《Virologica Sinica》：The HSV-1
US1 gene product targets the histone chaperone ASF1 to suppress H3K9 acetylation
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1型单纯疱疹病毒（HSV-1）通过协调影响转录因子、RNA聚合酶II、转录起始与延伸以及宿主染色质动态来调控宿主和病毒转录。然而，HSV-1蛋白如何调控宿主组蛋白伴侣和组蛋白修饰仍不完全清楚。本研究鉴定了HSV-1即早期蛋白ICP22与抗沉默功能1（ASF1）
1型单纯疱疹病毒（HSV-1）通过协调影响转录因子、RNA聚合酶II、转录起始与延伸以及宿主染色质动态来调控宿主和病毒转录。然而，HSV-1蛋白如何调控宿主组蛋白伴侣和组蛋白修饰仍不完全清楚。本研究鉴定了HSV-1即早期蛋白ICP22与抗沉默功能1（ASF1）之间的功能关系，ASF1是一种具有两种人源异构体ASF1a和ASF1b的组蛋白伴侣。在转染和HSV-1感染的细胞中，ICP22与两种ASF1异构体均结合。与野生型HSV-1感染相比，ICP22缺失在很大程度上恢复了ASF1转录本和蛋白水平，并减弱了组蛋白H3第9位赖氨酸乙酰化（H3K9ac）的降低。任一ASF1异构体的缺失均降低了基础H3K9ac水平，而ASF1的恢复可抵消ICP22相关的H3K9ac降低，支持ASF1与H3K9ac调控之间的功能联系。整合的H3K9ac CUT&Tag和RNA测序进一步显示，ICP22的存在与宿主基因组位点上H3K9ac占据减少及一致的转录变化相关。在所检测的实验条件下，ICP22表达还降低了ASF1与组蛋白H3之间可检测的结合。值得注意的是，任一ASF1异构体的完全缺失均损害了野生型和ICP22缺失病毒的复制，表明基础ASF1功能对于高效的HSV-1复制仍是必需的。总之，这些发现将ASF1相关的H3K9ac调控鉴定为ICP22介导的宿主染色质重塑的一个此前未被认识的组成部分，并揭示HSV-1调节而非完全失活一种生产性感染所需的ASF1依赖性宿主功能。
研究背景方面，1型单纯疱疹病毒（HSV-1）是一种广泛感染全球大量人群的人类病原体，除典型的口面部病变外，还可引起单纯疱疹脑炎等严重疾病，并在免疫缺陷个体中造成危及生命的感染。HSV-1在感觉神经元中建立终身潜伏，周期性再激活导致复发疾病和病毒传播。成功的感染和再激活需要对病毒和宿主基因表达进行精确调控，这通常通过操纵宿主转录和表观遗传机制实现。组蛋白修饰是HSV-1破坏宿主基因组转录、创造有利于病毒基因表达的染色质环境的关键策略。HSV-1编码五种即早期（IE）蛋白ICP0、ICP4、ICP22、ICP27和ICP47，其中ICP0、ICP4和ICP22已被报道通过不同机制调节组蛋白修饰。ICP22已被报道可增加宿主基因上H3K27me3沉积，通过沉默宿主转录促进病毒复制；然而，ICP22是否也调节组蛋白乙酰化以促进HSV-1基因表达和复制仍知之甚少。ASF1是一种高度保守的组蛋白伴侣，在DNA复制依赖性或非依赖性染色质重塑过程中的核小体组装中发挥关键作用，通过调节组蛋白H3-H4二聚体的掺入和驱逐影响转录激活和抑制。ASF1有两种异构体ASF1a和ASF1b，具有重叠的H3-H4处理和核小体组装功能，但也表现出不同的表达模式和生物学功能。鉴于ASF1在染色质动态中的核心作用，它是病毒操纵的有吸引力的靶标，但其在HSV-1感染中的功能尚未被探索。研究人员开展了ICP22与ASF1功能关系的研究，得出以下结论：ICP22与ASF1a和ASF1b结合，在HSV-1感染期间促进其转录本和蛋白水平降低；ICP22表达降低了ASF1与组蛋白H3之间可检测的结合，并与细胞H3K9ac丰度降低及部分宿主基因上H3K9ac占据和转录的差异相关；任一ASF1异构体的完全缺失均损害HSV-1复制，表明基础ASF1功能对于高效感染仍是必需的。这些发现确立了HSV-1感染期间ICP22、ASF1和H3K9ac调控之间此前未被认识的功能关系，具有重要意义。
在技术方法方面，研究人员主要采用了免疫共沉淀-质谱联用（IP-MS）鉴定ICP22相互作用蛋白；免疫共沉淀（co-IP）和免疫荧光显微镜验证蛋白相互作用与共定位；CRISPR/Cas9基因编辑技术构建ICP22缺失病毒株（ΔICP22）及ASF1a/ASF1b敲除的293T细胞系（293T
ASF1a-/-和293T
ASF1b-/-）；Western blotting检测蛋白和组蛋白修饰水平；H3K9ac CUT&Tag结合RNA测序（RNA-Seq）分析全基因组H3K9ac占据和转录变化；RT-qPCR验证；荧光素酶报告病毒和病毒生长曲线（多步生长动力学）评估病毒复制。研究所用HSV-1 F株由Guoying Zhou（广州医科大学）惠赠，HSV-1-Luc-GFP报告病毒由Chunfu Zheng（卡尔加里大学）提供，293T和Vero细胞购自美国典型培养物保藏中心（ATCC）。
研究结果方面：第一，ICP22在HSV-1感染期间与内源性ASF1a和ASF1b相互作用。通过IP-MS分析鉴定ASF1a为ICP22潜在相互作用伙伴，co-IP实验证实ICP22与两种ASF1异构体相互作用，免疫荧光显示ICP22与ASF1在核颗粒中共定位，感染细胞中病毒表达的ICP22与内源性ASF1a/ASF1b核定位重叠，感染细胞co-IP证实ICP22与内源性ASF1a/ASF1b结合。第二，ICP22下调ASF1表达和H3K9ac水平。Western blotting显示HSV-1感染可下调ASF1a和ASF1b表达，与野生型感染相比，ICP22敲除后两种ASF1异构体表达大幅恢复；HSV-1感染显著降低ASF1a和ASF1b转录本水平，而ΔICP22感染中此降低基本消失；HSV-1感染后4 hpi和8 hpi H3K9ac降低；ΔICP22感染细胞中H3K9ac水平高于野生型感染细胞；过表达ICP22显著降低H3K9ac水平。第三，ASF1敲除减弱HSV-1相关的H3K9ac变化。CRISPR/Cas9构建ASF1a和ASF1b敲除细胞系，敲除细胞中基础H3K9ac水平显著低于野生型293T细胞；野生型细胞中HSV-1感染导致的H3K9ac下调在ASF1a缺失细胞中不明显，ASF1b敲除细胞中观察到类似现象；过表达ASF1a或ASF1b可显著提高HSV-1感染细胞的H3K9ac至接近模拟感染水平。第四，ICP22介导的H3K9ac降低与ASF1功能相关。在ASF1a或ASF1b敲除细胞中，ICP22对H3K9ac降低的影响在ΔICP22感染与HSV-1或模拟感染之间基本消失；单独表达ICP22降低H3K9ac，而共表达ASF1a或ASF1b可恢复H3K9ac水平。第五，ICP22缺失与宿主基因组H3K9ac占据增加相关。H3K9ac CUT&Tag显示ΔICP22感染与宿主基因组区域更高的相对H3K9ac富集相关，而病毒基因组总体H3K9ac信号在WT和ΔICP22感染间无显著差异；整合RNA-Seq和CUT&Tag显示ΔICP22感染中上调基因富集于细胞核、核小体和染色质，FOXC1和JMJD8等代表性宿主基因H3K9ac峰显著增加，与RNA-Seq观察到的mRNA水平升高一致，qPCR进一步验证。第六，ICP22破坏ASF1与组蛋白H3的结合。co-IP实验显示表达ASF1a-Myc或ASF1b-Myc的细胞中ASF1与H3共沉淀，而ICP22破坏ASF1与H3的结合。第七，ASF1a和ASF1b是高效HSV-1复制所必需的。荧光素酶报告病毒实验显示ASF1敲除细胞中荧光素酶活性显著降低，GFP成像显示报告信号和感染扩散减少；多步生长分析显示WT和ΔICP22病毒在ASF1缺陷细胞中复制均明显受损，且亲本细胞中WT与ΔICP22病毒产量的差异在ASF1a或ASF1b缺失后大幅缩小；在敲除细胞中重新表达相应ASF1异构体可大幅提高WT病毒产量（72 hpi），而ΔICP22病毒产量恢复较为有限。
讨论部分总结：HSV-1广泛重编程宿主染色质以促进其转录级联和生产性复制。本研究鉴定病毒即早期蛋白ICP22为组蛋白伴侣ASF1的调控因子，从而将ICP22与感染期间宿主染色质动态联系起来。与VZV IE63增强ASF1与H3结合不同，HSV-1 ICP22在co-IP实验中降低了可检测的ASF1-H3结合，提示两种同源病毒蛋白对ASF1-H3复合物形成发挥不同作用。ICP22通过ASF1调控H3K9ac的机制尚未完全阐明，但ASF1敲除和回补实验强烈支持ICP22在HSV-1感染期间抑制H3K9ac的必要性和高效性高度依赖于ASF1。CUT&Tag分析未检测到WT和ΔICP22感染间病毒基因组归一化H3K9ac信号的显著差异，因此数据未提供ICP22将H3K9ac从宿主基因组重新分布至病毒基因组的证据。由于ICP22还调控RNAPII和其他转录相关因子，宿主H3K9ac变化不能完全归因于ASF1-H3结合的破坏；且ICP22缺失可能改变其他病毒基因表达，WT与ΔICP22感染的比较不能区分ICP22本身效应与病毒转录程序改变引起的继发效应。ASF1在正常条件下结合H3-H4组蛋白二聚体并促进其沉积至染色质，从而维持H3K9乙酰化。完全缺失任一ASF1异构体均显著损害WT和ΔICP22病毒复制，表明基础ASF1功能是高效HSV-1复制所必需的；ICP22并非通过简单消除ASF1活性促进HSV-1复制，而可能是在保留基础ASF1活性的细胞中调节ASF1丰度和ASF1相关染色质功能。
研究结论部分翻译：总之，研究结果表明ICP22与ASF1a和ASF1b结合，并在HSV-1感染期间促进ASF1丰度降低。ICP22的存在或缺失还与部分宿主基因上H3K9ac占据和转录的差异相关。此外，ICP22表达降低了ASF1与组蛋白H3之间可检测的结合，而ASF1恢复可抵消ICP22相关的H3K9ac降低。功能分析进一步表明基础ASF1功能是高效HSV-1复制所必需的。总之，这些发现将ASF1相关的H3K9ac调控鉴定为HSV-1感染期间ICP22介导的宿主染色质重塑的一个此前未被认识的组成部分。
