高、低抗逆性民猪感染PRRSV后肺与淋巴结代谢组差异及脱氧腺苷促猪巨噬细胞增殖的探索性研究

《Virus Research》：Decoding PRRS Resilience: The Metabolic differences of High- and low- resilience Pigs

　　

研究人员比较了感染PRRSV（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus，PRRSV）后高、低抗逆性（resilience）民猪（Min pigs）肺和淋巴结组织的非靶向代谢组谱（untargeted metabolomic profiles），并鉴定出与宿主恢复相关的差异代谢物，包括酰基肉碱类（acylcarnitine species）、丙酰肉碱（propionylcarnitine）和脱氧腺苷（deoxyadenosine）。研究显示，酰基肉碱类在两种组织中均一致映射至脂肪酸氧化通路（fatty acid oxidation pathway），作为名义富集（nominally enriched）的假设生成性（hypothesis-generating）发现。脱氧腺苷在高抗逆性动物淋巴结组织中上调，并在体外（in vitro）25 μM条件下促进猪巨噬细胞（3D4/21细胞）增殖，提示其可能增强免疫细胞功能并有助于改善对PRRSV的抗逆性。

研究背景与问题：猪繁殖与呼吸综合征（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome，PRRS）由PRRSV（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus，PRRSV）引起，传染性强、易变异并持续流行，常规防控和商品疫苗保护有限。抗逆性（resilience）指病原挑战下维持生产性能和健康的能力，被视为有前景的育种目标，但PRRSV抗逆性的代谢层面分子机制了解不足，缺乏可靠选择标志物。代谢组学可揭示疾病相关代谢变化并发现早期代谢标志物；既往研究中，Qiao et al.发现高铜日粮致猪肾毒性与53种代谢物及甘油磷脂、鞘脂通路改变有关，Zhang et al.发现溶血磷脂酸（lysophosphatidic acid，LPA）可作为PRRSV临床诊断的血清代谢标志物。PRRSV主要靶细胞为单核巨噬细胞，尤其肺泡巨噬细胞（Pulmonary Alveolar Macrophages，PAMs），感染损伤肺组织并可致间质性肺炎和肺泡间隔增厚，持续感染系统性淋巴结导致持续病毒血症；肺和淋巴结是研究PRRSV持续感染和恢复的重要组织。因此，研究人员以抗病性较强的民猪（Min pigs）为对象，比较PRRSV感染后高、低抗逆性个体的肺和淋巴结代谢组，旨在识别差异代谢物和紊乱通路，阐明PRRS抗逆性的代谢基础并发现候选标志物。

研究人员开展了PRRSV感染民猪的代谢组比较及脱氧腺苷（deoxyadenosine）体外功能验证，结论提示酰基肉碱类（acylcarnitine species）和丙酰肉碱（propionylcarnitine）在肺、淋巴结中差异，支链脂肪酸氧化（Oxidation of Branched Chain Fatty Acids）通路呈名义富集趋势，脱氧腺苷与高抗逆表型相关并可促进猪巨噬细胞增殖。其意义在于为PRRS抗逆性的代谢机制提供假设和候选标志物线索，但作者强调结果为探索性，候选标志物需大队列验证后才能用于育种或诊断。

关键技术方法：研究使用15头28日龄健康去势雄性民猪队列（无既往疫苗/病史，同环境同饲饮水），第7天鼻内接种2 mL PRRSV CHsx1401株（基因亚型2谱系1 NADC30-like病毒，10⁵ TCID₅₀/mL），记为感染后0天（0 dpi，days post-inoculation）；28 dpi按攻毒后/前平均日增重（average daily gain，ADG）比值并结合体温轨迹和临床症状评分，选高、低抗逆性各5头（另5头中间表型未纳入），取肺和淋巴结100 mg。采用液相色谱-质谱联用（Liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）非靶向代谢组，经质量控制归一化和数据库鉴定后，用metaX行正交偏最小二乘判别分析（Orthogonal Partial Least Squares-Discriminant Analysis，OPLS-DA）及置换检验，MetaboAnalyst 6.0行通路富集；以3D4/21猪巨噬细胞经脱氧腺苷处理，用细胞计数和CCK-8（Cell Counting Kit-8）验证增殖。

研究结果：
3.1 表型筛选结果：通过ADG、体温和临床症状评分分组。高抗逆组ADG稳定且显著高于低抗逆组（P < 0.01）；28 dpi高抗逆体温多恢复至约39.5°C且症状基本消失；低抗逆增重慢或负，部分体温>40.0°C，鼻漏咳嗽持续；血清病毒载量（循环阈值，cycle threshold，Ct）和PRRSV特异性抗体（S/P ratio）组间无显著差异，提示病毒暴露可比。
3.2 正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）：两组样本明显分离无重叠；肺R²Y=0.996、淋巴结R²Y=0.995，置换检验R²和Q²支持模型有效，R²Y>Q²Y，无过拟合。
3.3 差异代谢物筛选：按变量投影重要性（Variable Importance in Projection，VIP）>1、p<0.05、倍数变化（Fold Change，FC）>2或<0.5筛选；肺13个（高抗逆上调7个，含磷脂酰甘油（phosphatidylglycerol，PG）(18:1(11Z)/22:5(7Z,10Z,13Z,16Z,19Z))和甘胆酸；下调6个，含acylcarnitine 20:2和L-酪氨酸）；淋巴结27个（上调19个，含epoxidized fatty acid等；下调8个，含磷脂酰胆碱（phosphatidylcholine，PC）(18:4/20:5)、羟基脂肪酸（isomer 1）和2-羟基己酸）；脱氧腺苷在高抗逆淋巴结上调（FC=2.12，p=0.0234）。
3.4 通路富集分析：肺13个和淋巴结27个差异代谢物分别富集；肺按p值前7通路包括胆汁酸生物合成、甲状腺激素合成、支链脂肪酸氧化、儿茶酚胺生物合成等；淋巴结前4包括亚精胺和精胺生物合成、支链脂肪酸氧化、嘌呤代谢等；经Benjamini-Hochberg错误发现率（false discovery rate，FDR）校正后均不显著，报告为名义富集趋势和假设生成；两组织一致趋势为支链脂肪酸氧化（nominal p≈0.10）。
3.5 脱氧腺苷对细胞数影响：3D4/21细胞不同浓度处理24 h计数，25 μM组细胞数显著高于对照和其他浓度（P < 0.05）。
3.6 脱氧腺苷对细胞增殖影响：CCK-8显示25 μM在12 h和24 h显著促进3D4/21增殖（P < 0.05）；超过25 μM无促进或抑制。

讨论总结：PRRSV持续变异使疫苗效果受限，遗传育种提高抗逆性重要；代谢组学与表型密切相关。肺和淋巴结因PRRSV持续感染和淋巴器官定植被选。酰基肉碱类和丙酰肉碱差异提示肉碱代谢物参与恢复；乙酰肉碱可抑制核因子κB（nuclear factor κB，NF-κB）通路下游促炎因子肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素1β（IL-1β）和白细胞介素6（IL-6）释放，丙酰肉碱作为短链脂肪酸代谢中间体促进线粒体能量代谢并具抗氧化抗炎作用，提示高抗逆组处于代谢平衡和轻度炎症状态，减少肉碱需求。支链脂肪酸氧化通路由acylcarnitine驱动，酰基肉碱是长链脂肪酸进入线粒体β氧化的酯化中间体，连接脂肪酸氧化与线粒体能量产生及免疫代谢调节；β氧化支持抗炎和组织修复，受损可促巨噬细胞促炎状态。磷脂酰胆碱在肺上调、淋巴结下调，提示组织特异和膜/脂蛋白重塑，应谨慎解释。脱氧腺苷在淋巴结高抗逆组上调，25 μM促3D4/21数量和增殖，原文提出其可能经嘌呤补救和P1嘌呤能（腺苷受体）信号，与淋巴结嘌呤代谢名义富集一致；但3D4/21为贴壁巨噬细胞，≤100 μM 24 h存活率≥90%，而脱氧腺苷对淋巴样细胞持续超生理暴露有细胞毒性，故效应呈钟形并依赖细胞类型和暴露时间，机制未定，体外证据初步；仅脱氧腺苷功能验证，其余相关。局限性包括每组5头样本小、仅28 dpi单时间点横断面、相对定量无同位素内标、不能完全排除病毒复制差异、候选代谢物为代谢组学标准倡议（Metabolomics Standards Initiative，MSI）level 2推定而未用标准品确认。

结论翻译：本研究利用肺和淋巴结组织代谢组分析，揭示高、低抗逆性民猪在肺和淋巴结组织中分别存在酰基肉碱类和丙酰肉碱差异，提示肉碱代谢物可能在PRRSV感染后宿主恢复机制中发挥关键作用。值得注意的是，两种组织代谢组数据均显示支链脂肪酸氧化通路呈一致的名义显著富集趋势，被解释为假设生成性。此外，脱氧腺苷在体外促进猪巨噬细胞增殖，并与抗逆表型相关。候选代谢物中仅脱氧腺苷在体外进行了功能验证。这些探索性发现为PRRS抗逆性的代谢基础提供了假设；候选标志物需在更大队列中验证后，方可应用于育种或诊断。