《Virus Research》：Interactions of canine and feline
Alphacoronavirus suis strains with receptors of their natural hosts and humans
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摘要：本研究采用计算机模拟（in silico）方法评估了猪α冠状病毒（Alphacoronavirus suis）受体结合域（RBD）与不同宿主物种氨基肽酶N（APN）受体的相互作用。结果显示，猪α冠状病毒的RBD与人APN的结合自由能（ΔG）低于与动物受体
摘要：本研究采用计算机模拟（in silico）方法评估了猪α冠状病毒（Alphacoronavirus suis）受体结合域（RBD）与不同宿主物种氨基肽酶N（APN）受体的相互作用。结果显示，猪α冠状病毒的RBD与人APN的结合自由能（ΔG）低于与动物受体的结合自由能。APN的N-连接糖基化改变了RBD-APN复合物的结合自由能和氢键模式。若干天然存在的RBD突变被预测可改善其与人及动物APN的相互作用能。这些发现支持对猪α冠状病毒进行进一步的实验研究和人畜共患风险监测。
论文解读文章
研究背景与科学问题
冠状病毒作为持续性病原体，对人类及其他生物构成威胁，其与宿主间的共进化过程备受关注。过去二十年间，三种新型冠状病毒——SARS-CoV、MERS-CoV和SARS-CoV-2——先后引发疫情，凸显了冠状病毒跨种传播的风险。近期，猪δ冠状病毒（PDCoV）以及两种犬冠状病毒株（CCoV-HuPn-2018和HuCCoV_Z19）在人样本中被检出，且后两者在不同国家的多名患者体内反复分离到，表明这些病毒在人类中的出现并非偶然事件。这些毒株均属于猪α冠状病毒（Alphacoronavirus suis，亦称Alphacoronavirus 1）物种，该物种包含生物学特性各异的犬、猫及猪冠状病毒。鉴于COVID-19大流行的严重后果，每一次冠状病毒的跨种传播事件都值得深入研究。
冠状病毒表面刺突糖蛋白（spike glycoprotein）负责介导病毒进入细胞，其中受体结合域（receptor-binding domain, RBD）在与受体结合中发挥核心作用。已知多种冠状病毒利用氨基肽酶N（aminopeptidase N, APN）作为受体，包括传染性胃肠炎病毒（TGEV）、血清II型犬冠状病毒（CCoV）和猫冠状病毒（FCoV）。然而，APN介导的受体兼容性不仅取决于受体蛋白序列本身，还受到N-连接聚糖的重要影响。实验研究表明，犬和猫APN中位于RBD相互作用区域的N-连接聚糖是决定某些猪α冠状病毒株受体特异性的关键因素，而人APN缺乏相应的糖基化位点，因此通常不能支持这些病毒通过APN依赖途径进入细胞。尽管如此，猪α冠状病毒相关病毒在人体内的反复检出，以及可能存在替代进入机制，为进一步研究受体兼容性的结构和能量决定因素提供了依据。
研究内容与主要结论
研究人员采用计算机模拟（in silico）方法，系统研究了猫和犬源猪α冠状病毒的RBD与其自然宿主及人类APN受体的预测兼容性，特别关注了新描述的CCoV-HuPn-2018（HuCCoV_Z19）和FCoV-23毒株。研究旨在比较RBD-APN复合物的结构与能量特性，包括APN糖基化的影响，并鉴定可能改变与人APN预测相互作用的RBD氨基酸替换。研究结果为理解受体兼容性的分子决定因素和可能的受体适应途径提供了重要假说，支持进一步开展实验研究和人畜共患风险监测。
关键技术方法
本研究综合运用多种计算技术。首先，从NCBI数据库获取病毒全基因组及刺突蛋白氨基酸序列，使用Needleman-Wunsch算法和BLOSUM62矩阵进行成对序列比对，通过MUSCLE算法进行多重序列比对，基于最大似然法构建系统发育树，并使用RDP4软件进行重组分析。其次，以RCSB PDB结构7U0L为模板，通过同源建模构建RBD-APN三维复合物模型，利用SWISS-MODEL、VoroMQA、ERRAT和MolProbity等工具评估模型质量。结合自由能（ΔG）通过HawkDock v2服务器采用MM/GBSA方法计算，突变效应则同时使用mCSM-PPI2、BeAtMuSiC、MutaBind2和SAAMBE-3D四种独立工具进行预测。最后，使用GROMACS 2023.3软件和CHARMM36m力场进行分子动力学模拟，通过MM/PBSA计算轨迹期间的结合自由能变化，并进行主成分分析（PCA）生成自由能景观（FEL）。
研究结果
3.1 猪α冠状病毒刺突蛋白序列的变异性
研究人员分析了不同血清型和生物型的猫、犬冠状病毒刺突蛋白的氨基酸序列变异。结果表明，血清I型和II型毒株形成两个不同的簇。血清II型内部，CCoV-IIc A76毒株与其他毒株差异最大；CCoV-IIb 341/05毒株与CCoV-HuPn-2018和HuCCoV_Z19以及猪源毒株TGEV Miller M6和PRCoV AR310聚类在一起；CCoV-IIa 1-71、CCoV-IIa CB/05、FCoV-23、FECV-II 79-1683和FIPV-II 79-1146毒株则共同聚类。值得注意的是，基于全长基因组的系统发育树与基于刺突蛋白编码序列的系统发育树拓扑结构不一致，提示可能存在涉及刺突基因的重组事件。重组分析确认FCoV-23中存在一个跨越刺突编码区的重组片段，其亲本分别来自FCoV血清I型和CCoV-IIa CB/05毒株。在RBD区域内，研究人员识别出17个可变位点，其中多数为保守或中度保守的氨基酸替换，但也存在中度至高度激进的替换。
3.2 RBD-APN复合物的三维建模及RBD突变对其稳定性的预测影响
所有建模的RBD-APN复合物展现出相似的三级结构拓扑。结合自由能计算显示，大多数毒株的RBD与自然宿主APN的相互作用比与人APN更有利，但FECV-II 79-1683毒株例外。对于新近出现的重组毒株FCoV-23，其与猫APN的预测结合优于经典血清II型毒株。人源犬冠状病毒CCoV-HuPn-2018（HuCCoV_Z19）与犬APN的结合也优于经典CCoV-IIa 1-71毒株。通过分析294条猪α冠状病毒刺突蛋白序列，研究人员筛选出可能稳定RBD-APN复合物的自然突变。对于FCoV-23，11个突变（如M320K、H361R）可增强与猫APN的结合，5个突变（如A312R、M320K、H361R）可增强与人APN的结合，其中后者使复合物稳定性接近野生型FCoV-23与猫APN的水平。对于CCoV-HuPn-2018（HuCCoV_Z19），6个突变（如Q592R）可增强与犬APN的结合，另有6个突变（如Q592R、E599R）可增强与人APN的结合，其中Q592R和E599R突变后与人APN的结合甚至优于野生型与犬APN的结合。
3.3 RBD-APN复合物的糖基化分析与分子动力学模拟
分子动力学模拟比较了FCoV-23和CCoV-HuPn-2018（HuCCoV_Z19）的RBD与各自自然宿主及人APN形成的复合物。研究发现，猫APN的N740位和犬APN的N747位的糖基化显著影响了RBD-APN的相互作用。在未糖基化状态下，FCoV-23 RBD与猫APN的复合物比与人APN的复合物更稳定，但加入N740位聚糖后，猫APN复合物的稳定性进一步增强。对于CCoV-HuPn-2018（HuCCoV_Z19），未糖基化时与犬APN的复合物最稳定，但加入N747位聚糖后，犬APN复合物的稳定性反而下降，这可能反映了糖链与RBD之间的空间位阻。此外，人APN因缺乏对应的糖基化位点，其复合物稳定性普遍较低。主成分分析和自由能景观分析显示，糖基化状态影响了复合物的构象空间和能量分布。
讨论与结论
本研究通过计算机模拟揭示了猪α冠状病毒RBD与不同物种APN受体的相互作用特征。研究表明，尽管人APN缺乏关键的N-连接糖基化位点，但某些自然发生的RBD突变可能改善病毒与人APN的相互作用能，这为理解该类病毒的跨种传播潜力提供了新的视角。特别是，新发现的FCoV-23和已在人体中检测到的CCoV-HuPn-2018（HuCCoV_Z19）毒株，其RBD突变可能使其获得更强的受体结合能力。研究结果强调了对猪α冠状病毒进行持续监测和深入实验研究的必要性，以评估其人畜共患风险。
