宿主蛋白酶体与新加坡石斑鱼虹彩病毒（SGIV）互作机制及蛋白酶体抑制剂抗病毒潜力：PSMB6/PSMB7靶向与MG132的体内外评价

《Water Biology and Security》：Interplay between the host proteasome and Singapore grouper iridovirus: Mechanistic insights and antiviral potential of proteasome inhibitors

　　

新加坡石斑鱼虹彩病毒（SGIV，Singapore grouper iridovirus）蛋白与PSMB6和PSMB7结合，破坏宿主蛋白酶体（proteasome）的分布与功能；三种蛋白酶体抑制剂在体外抑制病毒复制（viral replication），且MG132的作用独立于游离泛素（ubiquitin）消耗；MG132减轻组织损伤、降低病毒载量，为抗鱼类虹彩病毒提供有前景的策略。

研究背景方面，新加坡石斑鱼虹彩病毒（SGIV，Singapore grouper iridovirus）是具二十面体结构的高致病性双链DNA病毒，可导致脾肿大、出血、肾肿胀等病变，死亡率可超过90%。现有疫苗需在感染前给药，对已进入活动性感染阶段的个体治疗获益有限，因此开发安全、高效、易给药的新型抗病毒药物具有重要意义。泛素-蛋白酶体系统（UPS，ubiquitin-proteasome system，细胞内蛋白质降解调控系统）参与病毒内体逃逸、核衣壳运输和基因组脱壳等早期环节；26S蛋白酶体由20S核心蛋白酶体（20S core proteasome，催化核心）及两端19S调节颗粒（19S regulatory particle，调节复合物）组成，多种病毒可通过与蛋白酶体亚基互作调控宿主蛋白酶体功能。既往研究显示UPS贯穿SGIV感染过程，蛋白酶体抑制可减弱SGIV复制，但SGIV蛋白与石斑鱼蛋白酶体亚基的互作机制及蛋白酶体抑制剂的体内抗病毒潜力仍需系统阐明。基于此，研究人员系统分析SGIV蛋白与石斑鱼蛋白酶体亚基PSMB5、PSMB6、PSMB7的互作，验证亚细胞定位与酶活变化，评价MG132、Epoxomicin和Bortezomib的体外抗SGIV作用，并在个体水平评估MG132的保护效果。研究结论表明，SGIV多个蛋白结合PSMB6/PSMB7并改变宿主蛋白酶体分布和功能，蛋白酶体抑制剂可剂量依赖抑制SGIV复制，MG132在体内提高存活、降低病毒载量并减轻组织损伤，为虹彩病毒-宿主互作机制及靶向蛋白酶体抗病毒策略提供了理论和实验依据。

关键技术方法：研究人员以AlphaFold 3预测162个SGIV编码蛋白与PSMB5/PSMB6/PSMB7的复合物，PRODIGY计算结合能，PyMOL分析界面；以免疫荧光共定位和免疫共沉淀（Co-IP，co-immunoprecipitation）验证候选互作；以发光法检测β1/β2/β5活性；以CCK-8评估细胞毒性；以RT-qPCR（含2^?ΔΔCt和绝对定量）和Western blot检测主要衣壳蛋白（MCP，major capsid protein）/VP19及泛素化蛋白；体内采用健康橙点石斑鱼（Epinephelus coioides，山东当地养殖场来源）进行MG132（10 mg/kg）预处理后SGIV（10⁷ TCID₅₀/mL）攻毒，观察14天并取肝、脾、头肾；GS细胞为实验室建立的赤点石斑鱼（Epinephelus akaara）脾脏细胞系，SGIV毒株实验室保存。

3.1 In Silico prediction of SGIV protein-proteasome subunit interactions：通过AlphaFold 3对162个SGIV蛋白与PSMB5/PSMB6/PSMB7两两对接，构建486个复合物模型；276个复合物结合能低于?9 kcal/mol，104、109、63个病毒蛋白分别与PSMB5、PSMB6、PSMB7形成稳定复合物。研究人员筛选10个候选蛋白进行验证，其中VP39、VP67、VP70、VP98、VP131、VP157与PSMB6互作，VP26、VP60、VP61、VP116与PSMB7互作，得出多个SGIV蛋白可与蛋白酶体亚基稳定结合的预测结论。

3.2 Validation of SGIV protein-proteasome subunit interactions：通过免疫荧光共定位和Co-IP验证，EcPSMB6与VP39、VP67、VP70、VP98、VP131、VP157呈胞质共定位，VP67/VP70/VP98/VP157可诱导EcPSMB6向胞质聚集，EcPSMB6-VP67互作改变双方定位；EcPSMB7与VP26、VP60、VP61、VP116共定位，VP26诱导EcPSMB7核到胞质转位，VP60使EcPSMB7呈全细胞分布，VP61使两者呈全细胞分布；Co-IP检测到相应互作，得出SGIV蛋白与EcPSMB6/EcPSMB7互作并重塑亚细胞定位的结论。

3.3 Proteasome activity alterations during SGIV infection：通过发光法检测β1（PSMB6）、β2（PSMB7）、β5（PSMB5）活性，体外MG132显著抑制三亚基活性，MG132联合SGIV仅β5显著抑制；体内肝组织中SGIV降低β1/β2活性，MG132抑制β2，联合处理抑制β2；脾组织中联合处理显著降低β1/β2/β5；头肾中联合处理显著抑制β1。原文指出这些组织特异差异可能与SGIV组织嗜性相关，得出SGIV和MG132对蛋白酶体活性呈组织特异调节的结论。

3.4 Dose-dependent inhibition of SGIV by proteasome inhibitors：通过CCK-8显示0.02–50 μM抑制剂处理24 h细胞存活率>80%；三种抑制剂浓度依赖减轻细胞病变效应（CPE，cytopathic effect），降低MCP和VP19 mRNA及MCP蛋白表达，得出MG132、Epoxomicin、Bortezomib剂量依赖抑制SGIV复制的结论。

3.5 Time-dependent antiviral effects and ubiquitin-independent mechanism：通过1 μM抑制剂处理并在12、24、36 hpi检测，三种抑制剂均降低MCP/VP19 mRNA和蛋白、减少MCP阳性细胞及荧光强度，并降低MCP DNA拷贝数和mRNA累积；MG132在12 hpi对MCP mRNA/蛋白抑制强于Bortezomib和Epoxomicin，后期差异减小；过表达HA-泛素后MG132仍抑制MCP，得出抑制剂作用于SGIV早中期关键步骤、MG132抗病毒作用不主要依赖游离泛素稳态的结论。

3.6 MG132 confers In vivo protection against SGIV：通过体内安全性评估，Epoxomicin和Bortezomib在0.1/1.0 mg/kg即引起死亡和异常，MG132在10 mg/kg无死亡或行为异常；SGIV单独感染组出现体色变暗、肝肿大暗红、脾肿大，MG132+SGIV组病变减轻；SGIV组第5天开始死亡、第8天累计死亡率80%，MG132预处理组第6天开始死亡、第8天累计死亡率40%，相对百分存活率（RPS，relative percent survival）为50%；组织病理显示MG132减轻肝、脾、头肾损伤；第1、3、5天MCP/VP19 mRNA、MCP DNA拷贝数和mRNA降低，得出MG132在体内提供保护并降低病毒载量的结论。

讨论部分总结：原文指出SGIV编码多个蛋白靶向同一宿主蛋白酶体亚基，结构蛋白VP98、VP116可能在病毒组装阶段调节蛋白酶体，非结构蛋白VP67、VP26可能在早期感染或免疫逃逸中发挥作用；病毒-蛋白酶体互作诱导EcPSMB6和EcPSMB7亚细胞重定位，原文认为可能将蛋白酶体活性集中于病毒组装位点或影响核内蛋白质量控制与转录调控；组织特异性酶活变化提示蛋白酶体功能受局部病毒载量和组织免疫微环境影响。三种抑制剂靶点与动力学不同：MG132可逆抑制β1/β2/β5，Epoxomicin优先不可逆抑制β5，Bortezomib主要抑制β5并在较高浓度影响β1；MG132较广谱可能有利于抗SGIV。MG132抗病毒不依赖游离泛素，但MG132为广谱抑制剂，可能影响NF-κB、内质网应激和凋亡等，本研究未系统评估。体内MG132单次预防给药10 mg/kg提高存活50%、延迟死亡、减轻病理并降低病毒DNA/转录，但未建立完整剂量反应和感染后治疗，未测Epoxomicin/Bortezomib体内效果，重复组有限；转化应用还受成本、给药途径、药物残留、免疫抑制风险和监管路径限制。

结论翻译：总之，本研究阐明SGIV通过多种病毒蛋白与石斑鱼蛋白酶体催化亚基结合，调节亚细胞定位和酶活性，从而促进复制；研究人员的发现表明蛋白酶体抑制剂可有效阻断SGIV感染，MG132的抗病毒活性独立于泛素水平调节，提示其他抗病毒靶点；这些发现推进了对虹彩病毒-宿主互作机制的理解，并为针对SGIV及相关水生病原的靶向抗病毒策略提供了理论基础。未来研究应聚焦SGIV蛋白（如VP67、VP26）与PSMB6/PSMB7结合的关键功能域，采用缺失定位和定点突变技术；优化MG132体内给药方案，包括剂量递增、替代给药途径（如经饲料口服）和延长治疗窗；并研究蛋白酶体抑制剂与疫苗或其他抗病毒剂（如小檗碱、姜黄素）联合的协同潜力。