《Legume Science》：Exploring Variations in Protein Composition in Pea Seeds and Processed Ingredients: A Comparative Analysis of Five Pea Varieties Using Targeted Parallel Reaction Monitoring Mass Spectrometry (PRM-MS)
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豌豆种子是可持续植物基蛋白的良好来源。提高其利用率将取决于对种子基质中决定品质的重要蛋白质获得精确的定量认识，并追踪其在加工过程中的变化。研究人员采用靶向平行反应监测质谱（parallel reaction monitoring mass spectromet
豌豆种子是可持续植物基蛋白的良好来源。提高其利用率将取决于对种子基质中决定品质的重要蛋白质获得精确的定量认识，并追踪其在加工过程中的变化。研究人员采用靶向平行反应监测质谱（parallel reaction monitoring mass spectrometry, PRM-MS）方法，对五个豌豆品种（CDC Lewochko、CDC Meadow、CDC Spectrum、CDC Amarillo和AAC Profit）中选定的主要和次要种子贮藏蛋白（豌豆球蛋白（vicilins）、豆球蛋白（legumins）、清蛋白（albumins）、脂氧合酶（lipoxygenases, LOX）和非特异性脂质转运蛋白（nonspecific lipid transfer proteins, nsLTP））进行了定量。豌豆粉中的蛋白质含量范围为CDC Meadow的22.9%至CDC Spectrum的29.0%。大多数豌豆粉中豌豆球蛋白丰度较高，其次为豆球蛋白、LOX、清蛋白和nsLTP，而CDC Spectrum中豆球蛋白丰度高于豌豆球蛋白。CDC Spectrum中三种已分类过敏原的含量均最低，而CDC Meadow和AAC Profit中含量最高。由高蛋白品种CDC Spectrum制备的蛋白浓缩物（protein concentrate）和蛋白分离物（protein isolate）分别含63.9%和88.3%的蛋白质。与豌豆粉和蛋白浓缩物相比，CDC Spectrum的蛋白分离物中豌豆球蛋白丰度相对较高，而LOX、清蛋白和nsLTP丰度较低，从而降低了其含硫氨基酸（sulfur-containing amino acids）含量。这种同时定量高丰度和低丰度种子蛋白的方法可支持未来作物开发和采后工艺设计工作流程，以选择和开发适用于定制食品应用的定制化蛋白配料。
豌豆（Pisum sativum L.）是重要的可持续植物基蛋白来源，干豌豆种子蛋白含量约23%–31%，豌豆粉富含赖氨酸但含硫氨基酸（sulfur-containing amino acids；甲硫氨酸、半胱氨酸）和色氨酸较低。种子贮藏蛋白（seed storage proteins）主要包括球蛋白（65%–80%）和清蛋白（albumins，10%–20%）；球蛋白包括豌豆球蛋白（vicilins，7S球蛋白）、豆球蛋白（legumins，12S球蛋白）和convicilins，其中Pis s 1（vicilin来源过敏原）、Pis s 2（convicilin来源过敏原）及非特异性脂质转运蛋白（nonspecific lipid transfer proteins, nsLTP；Pis s 3）被认定为过敏原。蛋白组成受遗传、环境、农艺和加工影响，并影响营养、功能、消化率、货架期和致敏性。传统十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、离子交换色谱、SEC-HPLC、RP-HPLC、2-D GE和质谱（mass spectrometry, MS）等方法在特异性、重现性和定量准确性方面不足，难以定量低丰度蛋白。为此，研究人员开发靶向平行反应监测（parallel reaction monitoring, PRM；靶向质谱采集模式）LC–MS/MS方法，同时定量主要和次要种子贮藏蛋白及过敏原，比较加拿大五个商业豌豆品种，并追踪高蛋白品种在粉、浓缩物和分离物中的蛋白相对丰度。该研究旨在建立可靠快速的相对定量方法、比较五个加拿大常用品种的目标蛋白水平、并映射高蛋白品种种子及加工配料中目标蛋白相对丰度；其意义在于支持品种选育、加工原料选择和工艺设计，以获得具定制功能和营养品质的蛋白配料。
关键技术方法：研究所用五种干豌豆种子为2021年加拿大Saskatchewan种植并购自当地供应商的商业样品，每种约100–150 kg，25 kg袋装，室温储存并于收获6个月内脱壳、研磨。CDC Spectrum脱壳种子经空气分级（air classification）制备蛋白浓缩物，研磨粉经碱提酸沉（alkaline extraction–isoelectric precipitation, AE–IEP）制备蛋白分离物。采用湿化学法测定近似组成与氨基酸（amino acid, AA）组成；总蛋白经提取、胰蛋白酶消化和S-Trap处理；以靶向PRM LC–MS/MS进行相对定量，Skyline用于肽段选择、峰积分和定量，iRT肽校准保留时间，牛血清白蛋白（bovine serum albumin, BSA）肽YLYEIAR作内参和校准标准，结果以ng BSA equivalent（ng BSAe）表示；数据用单因素方差分析（one-way analysis of variance, ANOVA）和Tukey HSD检验。
3.1 五种豌豆品种面粉的近似组成：湿化学分析显示水分8.29%–8.82%相似；蛋白22.9%–29.0%，CDC Meadow最低、CDC Spectrum最高；淀粉50%–56%，CDC Meadow最高；油约1%，灰分3.03%–3.32%，不溶性纤维高于可溶性纤维；CDC Spectrum浓缩物和分离物蛋白分别为63.9%和88.3%。
3.2 靶向PRM LC–MS/MS：用于PRM分析的目标肽段选择：选取vicilins（含provicilin、convicilin）、legumins、albumin、LOX和nsLTP五组、22个蛋白accessions，筛出11个2
+前体肽（5–25 aa），尽量选组内保守共同肽并避免已知翻译后修饰；用iRT肽校准保留时间，BSA肽YLYEIAR作内参。
3.3 靶向PRM LC–MS/MS：方法开发与优化：BSA肽稀释曲线为17.5–560 ng，YLYEIAR的R
2=0.997，检测限（limit of detection, LOD）16.3 ng BSA、定量限（limit of quantitation, LOQ）49.3 ng BSA；样品五次进样，所有目标肽平均变异系数（coefficient of variation, CV）<7%，表明定量一致性。
3.4 五品种面粉中目标蛋白类别的定量：PRM显示globulin最丰富且除CDC Spectrum外vicilin>legumin；vicilin以CDC Meadow和AAC Profit最高、CDC Spectrum最低；legumin以CDC Amarillo最高、AAC Profit最低；albumin以AAC Profit最高、CDC Spectrum最低；LOX和nsLTP以CDC Meadow最高、CDC Spectrum最低。相对比例AAC Profit vicilin 59.2%最高、CDC Spectrum 44.4%最低；legumin CDC Spectrum 47.6%最高、AAC Profit 31.4%最低；legumin-to-vicilin（L:V）比CDC Spectrum 1.07最高、AAC Profit 0.53最低；LOX 4.1%–5.3%，albumin 2.4%–3.9%，nsLTP 0.27%–0.33%。
3.5 五品种面粉中目标过敏原蛋白的定量：Pis s 1在CDC Meadow较高、CDC Spectrum最低；Pis s 2在CDC Spectrum最低、AAC Profit最高；Pis s 3在CDC Spectrum最低、CDC Meadow最高；总体上CDC Spectrum三种过敏原最低，CDC Meadow和AAC Profit较高。
3.6 CDC Spectrum面粉、浓缩物和分离物中目标蛋白类别的定量：选CDC Spectrum因总蛋白最高且过敏原最低；分级后浓缩物和分离物vicilin总体增加，粉与浓缩物分布相似但legumin相对丰度降1%、vicilin相应升；分离物albumin和LOX降低，nsLTP较粉显著降低；Pis s 1和Pis s 2在浓缩物和分离物增加，Pis s 3在浓缩物增加而与粉相比分离物无显著变化。
3.7 CDC Spectrum面粉、浓缩物和分离物的氨基酸（AA）组成分析：粉中Met 1.32、Cys 1.70，Glu、Asp、Arg最丰富；浓缩物和分离物Met降约20%–30%、Cys降约10%，除含硫氨基酸外其他必需氨基酸相对增加。
讨论部分总结：品种和加工影响蛋白组成及功能；灰分>1%可能与面包制作品质下降相关，浓缩物和分离物灰分增加；油含量低于1.2%，脱壳后面粉纤维约6–8%；蛋白提高不等于含硫氨基酸提高，因albumin等损失及vicilin富集；PRM较串联质量标签（tandem mass tag, TMT）和数据非依赖采集（data-independent acquisition, DIA）灵敏，可同时测高低丰度蛋白、无需化学标记且缩短MS时间；除CDC Spectrum外vicilin>legumin；L:V比影响功能，vicilin适合饮料和调味汁，legumin适合肉及乳类似物，CDC Spectrum更适合肉和乳类似物，AAC Profit和CDC Meadow更适合饮料和调味汁；albumin低但影响溶解、起泡和乳化，可用于育种；LOX与异味、nsLTP与过敏相关，宜选低含量品种或优化加工；局限是无独立生物重复、样本为商业来源，品种、环境、管理、储存和供应商效应不能完全分离，应解释为商业来源品种间差异，未来需多批次和生物重复。
结论翻译：本研究开发的PRM LC–MS/MS方法成功同时相对定量多种主要和次要种子贮藏蛋白，无需重复分析；可定量种子粉及加工蛋白浓缩物和分离物；CV<7%显示方法一致准确；L:V比差异说明品种选择对特定产品配方关键；粉、浓缩物和分离物中vicilin、legumin、albumin、LOX和nsLTP差异与既往加工诱导变化一致；方法可识别低丰度LOX和nsLTP的品种差异，可作为作物育种和食品应用选择工具；强调理解蛋白组成以优化豌豆蛋白在食品中的应用。
