《Translational Oncology》：Integrating single-cell and bulk RNA sequencing with ML algorithms identified MYBL2 as a candidate transcriptomic biomarker for diagnosing laryngeal squamous cell carcinoma (LSCC)
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专业术语翻译的摘要部分
本研究整合批量RNA测序（bulk RNA-seq）和单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据，结合机器学习（ML）算法，鉴定出MYBL2作为喉鳞状细胞癌（LSCC）的诊断性候选转录组生物标志物。研究人员通过差异表达基因（DEG）分析
专业术语翻译的摘要部分
本研究整合批量RNA测序（bulk RNA-seq）和单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据，结合机器学习（ML）算法，鉴定出MYBL2作为喉鳞状细胞癌（LSCC）的诊断性候选转录组生物标志物。研究人员通过差异表达基因（DEG）分析、加权基因共表达网络分析（WGCNA）及推断拷贝数变异（inferCNV）筛选，从批量与单细胞数据中交叉识别出16个候选诊断基因。经LASSO逻辑回归及受试者工作特征（ROC）曲线验证，MYBL2在三个独立数据集中均展现出稳健的LSCC诊断准确性（训练集AUROC=0.9712，验证集AUROC=0.9658，外部测试集AUROC达0.9624）。在单细胞层面，MYBL2标记了一个高拷贝数变异（high-CNV）的恶性上皮细胞亚群。MYBL2阳性肿瘤与细胞增殖、DNA修复通路激活及低免疫微环境状态显著相关。此外，细胞间通讯分析揭示了MDK、MIF和SPP1信号通路在LSCC中的潜在作用。综上，MYBL2是一个有前景的LSCC转录组生物标志物，反映了恶性上皮细胞状态及增殖程序，但其临床转化仍需进一步验证。
论文解读文章
研究背景与问题
喉鳞状细胞癌（LSCC）是头颈部最常见的恶性肿瘤之一，严重损害患者的发声、吞咽及气道维持功能。尽管手术、放化疗及靶向免疫治疗取得进展，晚期、复发或难治性LSCC患者的预后仍不理想。这主要源于LSCC在基因组、转录组、细胞及微环境层面的高度异质性——组织学诊断相似的肿瘤可能在增殖速率、侵袭转移潜能、治疗反应及复发风险上表现出显著差异。现有分子标志物如p16、表皮生长因子受体（EGFR）、Ki-67等虽有一定价值，但均无法全面捕捉LSCC的生物学复杂性。因此，迫切需要寻找能更精确反映肿瘤生物学行为和高危亚群的分子标志物。
研究目标与方法
研究人员旨在通过整合批量RNA测序（bulk RNA-seq）与单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据，结合判别分析、共表达网络、特征选择及机器学习（ML）算法，系统性地鉴定与LSCC恶性异质性和增殖表型相关的候选转录组标志物，并在独立队列中验证其预测性能。研究采用的主要关键技术方法包括：
- 1.
数据获取与预处理：从基因表达综合数据库（GEO）获取LSCC表达数据集，将GSE127165和GSE142083合并作为开发队列（经平衡后含218例样本，按约7:3随机分为训练集和验证集），保留GSE130605（100例样本）作为独立外部测试集。同时纳入GSE206332中的3例LSCC单细胞RNA测序数据。
- 2.
差异表达基因（DEG）分析与加权基因共表达网络分析（WGCNA）：利用limma包鉴定训练集中肿瘤与正常样本间的DEGs（|logFC|>2，校正P<0.01）；对前8000个高变异基因进行WGCNA，构建共表达网络并筛选与肿瘤状态高度相关的模块特征基因（|MM|≥0.55且|GS|≥0.55）。
- 3.
单细胞分析与恶性标志物鉴定：对scRNA-seq数据进行质量控制、标准化、聚类及细胞类型注释；通过初始inferCNV分析识别恶性样上皮细胞，随后对其进行再聚类；利用精细inferCNV分析区分高拷贝数变异（High-CNV）与低拷贝数变异（Low-CNV）亚群，并筛选High-CNV恶性上皮亚群的标志基因（avg_log2FC≥2，min.pct≥0.50，Bonferroni校正P<0.001）。
- 4.
候选生物标志物筛选与验证：取bulk上调DEGs、WGCNA肿瘤相关基因及High-CNV标志基因的交集获得16个候选基因；通过LASSO逻辑回归（十折交叉验证）进一步筛选，并对保留基因进行受试者工作特征（ROC）曲线分析（AUROC≥0.95为标准）；在独立外部队列中，利用随机森林（RF）和支持向量机（SVM）分类器评估MYBL2的分类效能。
研究结果
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差异表达基因（DEG）筛选：在训练集中鉴定出254个DEGs（86个上调，168个下调），火山图和热图展示了其表达模式。
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加权基因共表达网络分析（WGCNA）：构建了包含15个非灰色模块的共表达网络，其中蓝绿色模块与肿瘤状态呈最强正相关（r=0.8361，P=1.82×10??1），从中筛选出870个肿瘤相关特征基因。
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单细胞与恶性标志物结果：scRNA-seq分析鉴定了包括上皮细胞、T细胞、B细胞、髓系细胞等在内的主要细胞类群；通过inferCNV分析将恶性样上皮细胞分为14个亚群，最终保留10个High-CNV亚群，并鉴定出707个High-CNV恶性上皮标志基因。
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候选转录组生物标志物筛选：三种方法的交集获得16个候选基因。LASSO回归保留了MYBL2、KRT17、UCHL1、PTHLH和ODC1五个基因，其中仅MYBL2在训练集（AUROC=0.9712）和验证集（AUROC=0.9658）中均达到AUROC≥0.95的标准，且在两个队列中肿瘤组织表达均显著高于正常组织（P<0.001）。
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机器学习外部验证：在GSE130605独立队列中，基于MYBL2的SVM模型取得了优异的分类性能（AUROC=0.9624，准确率=0.870，灵敏度=0.780，特异度=0.960），优于随机森林模型（AUROC=0.9100，DeLong检验P=0.0056）。
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MYBL2相关免疫微环境：未经调整的分析显示，MYBL2高表达肿瘤中15种免疫细胞富集评分及基质、免疫、ESTIMATE评分均较低。但在校正肿瘤纯度后，大多数负相关性减弱，仅NK T细胞、调节性T细胞和未成熟B细胞仍保持显著关联。
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高CNV恶性上皮亚群特征及功能程序：10个High-CNV亚群呈现转录异质性。Cluster 0具有最高的平均MYBL2表达，而Cluster 8含有最高比例的MYBL2表达细胞。Cluster 8在E2F靶点、G2/M检查点、DNA修复及应激反应通路活性上略高，Cluster 0则在MYC靶点、上皮分化和衰老样评分上略高。
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批量水平验证及通路富集：Cluster 0和Cluster 8的特征基因集在开发队列和GSE130605的肿瘤组织中均显著富集，且MYBL2表达与这两个特征评分呈正相关（ρ分别为0.64和0.66，均P<0.001）。基因集富集分析（GSEA）表明MYBL2与E2F靶点（NES=4.21）、G2/M检查点（NES=4.05）、DNA修复（NES=2.58）及MYC靶点V1（NES=3.59）通路显著正相关。
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拟时序分析：DDRTree拟时序分析显示，在Cluster 0中MYBL2表达随推断的转录顺序增加并趋于平台期，而Cluster 8的表达相对稳定，在高拟时序值处表达较低。
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细胞间通讯分析：CellChat预测来自Cluster 0和Cluster 8的传出信号主要作用于髓系细胞等微环境群体，排名靠前的配体-受体对涉及MDK、MIF和SPP1信号通路。
讨论与结论
讨论总结：MYBL2在本研究中被确定为最一致的候选转录组生物标志物，其在独立队列中展现了可重复的肿瘤-正常鉴别能力。其生物学意义在于参与调控细胞周期进程、细胞增殖及基因组稳定性，并与多种增殖相关转录程序（E2F靶点、G2/M检查点等）密切相关。研究的优势在于整合了bulk与单细胞转录组证据，克服了各自局限性。单细胞分析揭示了MYBL2在不同恶性上皮亚群中的异质性表达模式。伪时间分析提示MYBL2可能反映动态的恶性细胞状态。免疫微环境分析强调了校正肿瘤纯度的重要性。细胞通讯预测了潜在的肿瘤-微环境互作机制。机器学习验证进一步支持了MYBL2的稳健性。研究局限性包括依赖回顾性公共数据集、单细胞样本量小、缺乏完整临床变量等。
研究结论翻译：本研究确定了MYBL2作为与LSCC中恶性上皮状态和增殖通路相关的候选转录组生物标志物。MYBL2在独立队列中展现出一致的肿瘤-正常鉴别能力，并与增殖相关转录通路及恶性上皮亚群相关联。未来需要在临床相关队列中进行进一步的生物学和临床验证，以确定其在LSCC分子分型和精准肿瘤学中的潜在作用。
