基于响应面法（RSM）的超声辅助低共熔溶剂（US-DES）同步提取养殖褐藻（Saccharina latissima）碳水化合物与蛋白质的优化研究

《Ultrasonics Sonochemistry》：Optimisation of ultrasound-assisted deep eutectic solvent extraction of carbohydrates and proteins from farmed brown seaweed ( Saccharina latissima) using response surface methodology

研究人员采用响应面法（Response Surface Methodology, RSM）对糖海带（Saccharina latissima, S. latissima）的超声辅助低共熔溶剂（Ultrasound-assisted Deep Eutectic Solvent, US-DES）提取工艺进行了优化。US-DES提取相较于单一方法在碳水化合物和蛋白质回收（recovery）方面表现更优。优化后的US-DES提取实现了83.54%的碳水化合物回收率和56.58%的蛋白质回收率。优化后的US-DES提取物表现出更高的岩藻糖（fucose）含量和抗氧化能力（antioxidant capacity）。傅里叶变换红外光谱（Fourier Transform Infrared Spectroscopy, FTIR）和扫描电子显微镜（Scanning Electron Microscopy, SEM）证实了提取后化学和结构的变化。

全球蛋白质与生物活性碳水化合物需求的持续增长，使传统作物生产面临资源与环境瓶颈。小麦、水稻、玉米及大豆等作物对淡水、耕地和化肥的高强度依赖，导致显著的温室气体排放与生态压力。海洋大型海藻，尤其是养殖褐藻糖海带（Saccharina latissima），因可在海洋环境中培育、无需农业用地与淡水灌溉，并具备生物固碳与营养盐去除潜力，被视为可持续替代来源。S. latissima干物质中蛋白质占3–12%，碳水化合物（包括alginate、laminarin和fucoidan）则具有免疫调节、抗氧化及凝胶特性，在食品、医药及化妆品领域应用广泛。然而，现有提取技术常依赖有毒、易挥发的有机溶剂或强酸，存在安全隐患与环境处置难题；水相提取虽环境友好，却选择性不足且溶解度有限。离子液体（Ionic Liquids, ILs）虽具可调理化性质，但多数未取得食品级安全认证，且合成成本高、生态毒理学数据不足。低共熔溶剂（Deep Eutectic Solvents, DESs）作为可设计的绿色溶剂，虽能通过氢键网络调控实现靶向提取，但其高粘度导致传质受限，效率有待提升。超声辅助提取（Ultrasound-assisted Extraction, US）产生的声学空化（Acoustic Cavitation）可形成微射流、冲击波与局部剪切力，有效破坏细胞壁并促进溶剂渗透，恰好弥补DES传质瓶颈。但既往研究多聚焦于单一组分（蛋白质或碳水化合物）的提取，针对S. latissima的蛋白质与碳水化合物同步回收及其系统工艺优化仍属空白。

针对上述不足，研究人员（Rifna E. Jerome、Nilushani Sivapragasam、Brijesh K. Tiwari及Gaurav Rajauria）开展了一项整合超声辅助提取与氯化胆碱-乳酸低共熔溶剂（ChCl-lactic acid DES）的研究，并采用响应面法（Response Surface Methodology, RSM）对同步提取工艺参数进行优化，论文发表于《Ultrasonics Sonochemistry》。研究得出，在88%超声振幅、12 min超声时间及3%固液比条件下，US-DES提取在30°C温和条件下即可实现83.54%的碳水化合物回收率（Carbohydrate Recovery Yield, CRY）和56.58%的蛋白质回收率（Protein Recovery Yield, PRY），效果优于单独超声、单独DES及常规酸性水提取。该工作为开发低能耗、高选择性的海藻生物炼制（Biorefinery）工艺及循环生物经济（Circular Bioeconomy）策略提供了重要的理论依据与技术支撑。

研究人员采用产自爱尔兰的养殖干燥糖海带（S. latissima）为样本，经80%乙醇预处理去除低分子量酚类、脂质及残余色素。低共熔溶剂由氯化胆碱（Choline Chloride, ChCl；作为氢键受体，Hydrogen Bond Acceptor, HBA）与乳酸（Lactic Acid；作为氢键供体，Hydrogen Bond Donor, HBD）按1:2摩尔比配制，添加40%水以降低粘度，体系pH约2.5。提取设备为UIP500hdT超声处理器（20 kHz，钛探头），在5°C循环水浴、维持≤30°C的条件下操作。实验采用Box-Behnken设计（BBD）响应面法（RSM），以超声振幅（70–90%）、超声时间（5–15 min）和固液比（3–7%）为自变量，以总可溶性碳水化合物（Total Soluble Carbohydrate, TSC）和总蛋白质含量（Total Protein Content, TPC）为响应值建立二阶多项式模型，运用desirability function进行多目标数值优化。提取液经离心后，分别采用BCA蛋白定量法、苯酚-硫酸法、DPPH自由基清除法、铁离子还原抗氧化能力（Ferric Reducing Antioxidant Power, FRAP）法及L-半胱氨酸比色法进行组分与活性分析，并通过傅里叶变换红外光谱（Fourier Transform Infrared Spectroscopy, FTIR）和扫描电子显微镜（Scanning Electron Microscopy, SEM）进行提取前后的化学与结构表征。

3.1. S. latissima的一般组成
研究人员通过常规组分分析发现，乙醇预处理后的干燥S. latissima干物质含量为92.02±0.08%，灰分为19.29±0.08%，碳水化合物占51.69±1.01%，蛋白质占9.06±0.22%，脂肪仅1.98±0.70%。该结果确认S. latissima是一种富碳水化合物、低脂质的生物质，非常适合同步开展蛋白质与碳水化合物的共回收研究。

3.2. 模型拟合
研究人员利用Box-Behnken设计（BBD）对TSC与TPC分别建立二次多项式回归模型。方差分析（ANOVA）显示，两个模型均高度显著（p<0.0001），决定系数R²分别为0.9993（TSC）和0.9810（TPC），调整R²（Adjusted R²）与预测R²（Predicted R²）亦表现良好，且失拟项（Lack of Fit）不显著，表明模型具有优异的预测精度与稳健性。

3.3. 提取工艺参数对总可溶性碳水化合物（TSC）的影响
研究人员通过响应面分析发现，超声振幅（线性系数β₁=27.01，p<0.0001）和超声时间（β₂=4.56，p=0.0044）对TSC具有显著正效应，而固液比（β₃=-106.19，p<0.0001）则呈显著负效应。振幅与固液比的交互项（AC）显著（p=0.0006）。最高实验TSC值达435.5±16.5 mg GE/g（90%振幅、10 min、3%固料比）。机制上，强化的声学空化产生微射流与局部剪切力，破坏S. latissima富含碳水化合物的致密凝胶状细胞壁；同时，乳酸与ChCl依据Kamlet-Taft参数通过氢键与静电作用破坏alginate、laminarin和fucoidan分子内与分子间交联，促进增溶。

3.4. 碳水化合物回收率（CRY）
研究人员由实测TSC推导出CRY，其变化趋势与TSC完全一致。在3%固料比、10 min超声条件下，振幅由70%提高至90%可显著增加CRY；在80%振幅、3%固料比下，超声时间由5 min延长至15 min同样提升CRY。较高的CRY归因于超声空化诱导的基质微裂与DES化学增溶之间的协同作用。

3.5. 提取工艺参数对总蛋白质含量（TPC）的影响
研究人员发现，TPC响应行为与碳水化合物存在明显差异。超声振幅对TPC呈显著正线性效应（p=0.0233），但存在极显著的负二次效应（p<0.0001），过高能量输入可能导致蛋白质变性、聚集或溶解度下降。最高实验TPC为51.7±1.03 mg BSAE/g（80%振幅、15 min、3%固料比）。固料比呈强烈负线性效应（p<0.0001），低固料比通过降低浆液粘度、减少碳水化合物屏蔽并改善空化渗透，显著促进蛋白质溶出。所有交互项均不显著，表明蛋白质提取主要由各参数的独立效应主导。

3.6. 蛋白质回收率（PRY）
研究人员由实测TPC推导出PRY，其变化规律与TPC一致。在优化条件下，最大PRY达到57.61%，超过了碱提酸沉法（约16.0%）、pH-shift法（最高25.1%）及水或酶法（通常低于30%）等常规方法的文献报道值，显示US-DES在蛋白质回收方面具有明显优势。

3.7. S. latissima的US-DES提取参数优化
研究人员运用desirability function对TSC与TPC同时进行数值优化，确定最佳操作窗口为：超声振幅88%、超声时间12 min、固料比3%。该条件下模型预测TSC为435.96 mg GE/g，TPC为51.91 mg BSAE/g，总desirability达到最大值1.00。

3.8. 模型验证
研究人员在最优条件下开展三次平行验证实验，实测TSC为431.09±17.48 mg GE/g，TPC为50.98±1.29 mg BSAE/g，对应CRY为83.54±3.18%，PRY为56.58±1.39%。实验值与RSM预测值偏差落在标准误范围内，证实模型在多次响应优化中的准确性与可靠性。

3.9. 提取策略的比较评估
研究人员通过Tukey检验对四种方法进行比较：常规酸性水提取效果最差（TSC 54.17 mg GE/g，TPC 5.15 mg BSAE/g）；单独超声有所改善但蛋白质回收仍受限（PRY 9.87%）；单独DES居中（TSC 164.42 mg GE/g，TPC 25.14 mg BSAE/g）；优化US-DES在所有响应指标上均显著最优（TSC 431.00 mg GE/g，TPC 50.98 mg BSAE/g）。超声通过空化机械效应破坏细胞壁，DES通过氢键与静电作用瓦解碳水化合物-蛋白质复合网络，二者协同实现了提取效率的阶跃式提升。

3.10. 提取技术对岩藻糖含量及抗氧化能力的影响
研究人员采用DPPH自由基清除实验与FRAP法评估体外抗氧化活性，优化US-DES提取物表现出最高的DPPH清除率（73.46±1.30%）和FRAP值（134.48±1.67 μM TE/mL extract）。岩藻糖含量同样以US-DES组最高（20.56±0.46 mg FE/g），其次为单独DES（13.14 mg FE/g）、单独超声（4.65 mg FE/g）和常规提取（0.95 mg FE/g）。需说明的是，该测定反映的是岩藻糖当量而非纯化fucoidan的直接回收，但足以证明US-DES条件对含岩藻糖硫酸多糖的富集效果最佳。

3.11. 提取物的FTIR表征
研究人员利用FTIR分析官能团变化。DES基体系在提取后于约1635 cm^-1处出现蛋白质酰胺I带（Amide I），约1234 cm^-1处出现硫酸根基团（S=O，归属于fucoidan）吸收，约3300 cm^-1处呈现β-葡聚糖O-H伸缩振动宽带。US-DES提取物的各特征峰强度最高，其次是单独DES、超声-酸性水及常规水提体系，光谱学证据进一步验证了提取效率的优劣顺序。

3.12. 提取后海藻残渣的形态学变化
研究人员借助SEM观察发现，乙醇预处理后的生物质表面致密完整；常规酸水提取仅引起轻微表面溶胀；单独超声产生局部凹坑、裂缝与孔隙（空化与声致穿孔效应）；单独DES导致表面粗糙、层状剥离与孔径扩大；优化US-DES处理的残渣则出现严重碎裂、高孔隙率及有序结构完全丧失。上述形态演变证实了机械解构与化学增溶的协同效应。

4. 结论
综上所述，超声辅助低共熔溶剂（US-DES）提取可在温和温度条件（30±1°C）下实现S. latissima中蛋白质与碳水化合物的高效同步回收。响应面法（RSM）优化的最佳工艺参数为：超声振幅88%、超声时间12 min、固料比3%。在此条件下，经实验验证的碳水化合物回收率达83.54%，蛋白质回收率达56.58%，提取物同时表现出73.46±1.30%的DPPH自由基清除活性、134.48±1.67 μM TE/mL extract的FRAP抗氧化能力及20.56±0.46 mg FE/g的岩藻糖含量。该研究表明，相较于单独超声或单独DES处理，US-DES集成策略在温和条件下具有显著优势。研究人员指出，未来需对富蛋白与富碳水化合物的组分进行分离纯化，并采用高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography, HPLC）进行鉴定与定量，同时开展分子量分布、结构解析等分子表征以确保提取物品质，为后续体内外生物活性评价及高附加值功能食品、营养保健品与生物医学应用奠定基础。