《Canadian Journal of Chemistry》：Isolation of cis-anemonin from the Canadian prairie crocus Pulsatilla nuttalliana and discovery of an equilibrium involving cis-anemonin, (S,S)-trans-anemonin, (R,R)-trans-anemonin, and protoanemonin
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加拿大草原白头翁（Pulsatilla nuttalliana）的提取物含有抗有丝分裂二聚丁烯内酯白头翁素（anemonin, 1）的外消旋体，该化合物于200多年前首次被发现。研究人员对白头翁素进行了深入研究，首次实现了trans-白头翁素对映体的拆分和构型
加拿大草原白头翁（Pulsatilla nuttalliana）的提取物含有抗有丝分裂二聚丁烯内酯白头翁素（anemonin, 1）的外消旋体，该化合物于200多年前首次被发现。研究人员对白头翁素进行了深入研究，首次实现了trans-白头翁素对映体的拆分和构型指认，并证明其可自发消旋化。在多种NMR溶剂中记录的trans-白头翁素样品的1H NMR谱中，一个持续存在的微量杂质被鉴定为新天然产物cis-白头翁素（3），并已证明cis-和trans-白头翁素立体异构体之间以及与它们的生物合成前体原白头翁素（protoanemonin, 2）之间处于平衡状态。研究人员获得了（R,R）-trans-白头翁素（1b）和cis-白头翁素（3）的单晶X射线衍射分析结构。P. nuttalliana提取物还含有已知化合物siderin（5）和新的类似物chlorosiderin（6）。
一、研究背景与科学问题
白头翁素（anemonin, 1）是一种对称的二聚丁烯内酯植物代谢产物，1792年由Heyer首次报道。1920年代，Asahina和Fujita通过从单体生物合成前体原白头翁素（protoanemonin, 2）合成二聚体，阐明了白头翁素的化学结构。然而，该二聚体在环丁烷环上的相对构型争议持续了30余年：Harris在其博士论文中提出两个内酯环在环丁烷环上为cis取向，但Moriarity等人通过单晶X射线衍射分析最终证明其为trans相对构型。Font等人随后利用手性镧系NMR位移试剂证明天然trans-白头翁素以外消旋混合物形式存在，但多次尝试拆分对映体均告失败。
自1792年发现以来的约230年间，白头翁素被赋予了广泛的生物活性。研究人员在阿尔伯塔草原植物粗提物筛选中发现，草原白头翁（Pulsatilla nuttalliana）粗提物可使HT-29结直肠癌细胞阻滞于有丝分裂期，呈现“纺锤体结构扭曲”的表型。生物测定指导的分馏鉴定出白头翁素为有丝分裂阻滞的活性来源，这是首次报道白头翁素具有阻滞细胞有丝分裂的能力。
基于白头翁素的手性特征和其两个丁烯内酯单元作为Michael受体的潜在反应性，研究人员开展了对映体拆分工作，以期评估单个对映体的抗有丝分裂活性。
二、研究内容与主要发现
研究人员完成了trans-白头翁素对映体的首次拆分，并发现纯对映体在溶液中可自发消旋化；鉴定出cis-白头翁素（3）为trans-白头翁素样品中持续存在的微量杂质，属新天然产物；发现cis-与trans-白头翁素立体异构体之间以及与生物合成前体原白头翁素（2）之间存在动态平衡；从提取物中还分离鉴定了已知化合物siderin（5）和新类似物chlorosiderin（6）。
三、关键技术方法
研究人员采集加拿大阿尔伯塔省南部春季的P. nuttalliana地上部分，干燥粉碎后以甲醇提取三次，合并提取液浓缩后水悬并用二氯甲烷萃取四次，所得粗胶经Sephadex LH20柱色谱（甲醇洗脱）分馏，再经反相HPLC纯化获得trans-白头翁素（1）、siderin（5）和chlorosiderin（6）。对映体拆分采用Daicel Chiralpak IA手性HPLC柱，以1:1异丙醇/己烷为流动相。结构鉴定综合运用了600 MHz NMR（1D 1H/13C及2D COSY、HSQC、HMBC、ROESY）、ECD光谱、HRESIMS和单晶X射线衍射分析等技术手段。
四、研究结果
1. trans-白头翁素对映体的拆分与绝对构型指认
利用手性HPLC成功拆分外消旋trans-白头翁素，获得峰A（早洗脱）和峰B（晚洗脱）两个对映体，二者1H NMR谱相同而CD谱符号相反。CD计算确定了绝对构型，单晶X射线衍射分析（Flack参数0.12(8)）确认早洗脱峰为（R,R）-trans-白头翁素（1b）。
2. 对映体的自发消旋化
对拆分后的对映体进行保存条件实验发现，干燥胶状样品在96 h后仍保持>90%对映体纯度，而溶于甲醇的样品已完全消旋化；溶于非极性溶剂二氯甲烷并在黑暗中放置96 h同样完全消旋化。时间进程实验表明，在甲醇或CDCl3中室温下完全消旋化需3–4天。
3. cis-白头翁素的发现与结构鉴定
在多种NMR溶剂中记录的trans-白头翁素1H NMR谱中始终存在一个微量双峰信号，反相HPLC也显示主峰前约2 min处有微量峰。收集该微量峰进行NMR分析，确认其为trans-白头翁素的异构体。2D NMR数据（COSY、HSQC、HMBC）表明其与trans-白头翁素具有相同分子式和结构组成；ROESY相关显示该异构体的β-烯烃质子仅与同一面且与β-烯烃相邻的环丁烷质子有相关，与trans-异构体中β-烯烃质子与环丁烷同面两个不同环境质子的相关模式不同，据此确定其为cis-白头翁素（3）。单晶X射线衍射分析证实了cis构型，该化合物以中心对称空间群P21/n结晶，为非手性化合物。
4. cis-与trans-白头翁素的相互转化**
室温下在CDCl3中，纯cis-白头翁素向trans转化约50%需1.4 h，6.9 h完全达到平衡；在DMSO-d6中约50%转化需6.9 h，48 h完全平衡。不同溶剂中平衡时trans/cis比例不同，从吡啶中的115:1到甲醇中的15:1不等。
5. 原白头翁素的参与及四组分动态平衡
将平衡后的cis/trans-白头翁素样品在MeCN-d3中加热至65–70°C，出现大量新化合物，经NMR数据与文献值对比鉴定为原白头翁素（2）。冷却浓缩后恢复为正常的cis/trans平衡混合物。室温时间进程实验表明，纯外消旋trans-白头翁素在DMSO-d6中约8 h达到trans/cis稳态平衡，而原白头翁素需40–50天才达到稳态浓度。将平衡样品在DMSO-d6中65°C加热19天后约90%转化为原白头翁素，冷却至室温后236天仍未完全恢复平衡。半定量实验得出相对反应速率顺序：trans-至cis-白头翁素 > cis-至trans-白头翁素 > （R,R）或（S,S）trans-白头翁素至外消旋trans-白头翁素 > trans-或cis-白头翁素至原白头翁素。
6. 对映体的抗有丝分裂活性
（R,R）和（S,S）trans-白头翁素对映体在HT-29生物测定中呈现相同的表型响应和IC50值，提示测定过程中发生消旋化或对靶蛋白无对映选择性共价结合。
7. 新天然产物chlorosiderin的结构鉴定
从提取物中分离的chlorosiderin（6）经NMR和MS数据分析确定结构，并由单晶X射线衍射分析确认。
五、讨论与结论
被称为“白头翁素”的材料并非单一化合物，而是（S,S）-trans-白头翁素（1a）、（R,R）-trans-白头翁素（1b）、（R,S）-cis-白头翁素（3）和原白头翁素（2）在室温下的高度动态平衡混合物。Font等人的工作表明混合物中手性trans组分以对映体混合物形式存在，但研究人员的拆分研究首次证明纯对映体在溶液中约24 h时间尺度内自发消旋化，而在室温下以胶状或玻璃态存在时构型稳定。cis-白头翁素的发现源于对HPLC纯化并多次结晶的“白头翁素”在DMSO-d6中1H NMR谱中持续微量烯烃信号的追踪。不同NMR溶剂中的研究表明cis-白头翁素始终存在但比例随溶剂变化。值得注意的是，Saidi等人2018年发表的1H NMR谱中也出现了该微量峰但未提及；许多其他文献在报道从植物提取物中分离“白头翁素”时均基于1H NMR数据鉴定结构，也都忽略了这一明显的微量信号。因此，cis-白头翁素在200多年间一直“隐藏于众目之下”。原白头翁素在室温下与cis-和trans-白头翁素存在平衡的发现表明，原白头翁素自发形成trans-白头翁素的反应在溶液中无光无热条件下也是自发可逆的。鉴于“白头翁素”平衡体系的动态性质，该材料被报道的众多生物活性无法归因于混合物中的任何特定组分。
