EBER flow FISH检测EBV感染细胞的跨机构重复性初步验证

《Cytometry Part B: Clinical Cytometry》：Comparison of EBER flow FISH results from two facilities

Epstein–Barr病毒（EBV）主要感染B细胞，但偶尔可靶向T和/或NK细胞，导致慢性活动性EBV病或EBV相关噬血细胞性淋巴组织细胞增生症，这些疾病常难以治疗。EBV相关疾病呈现广泛表型。EBV感染细胞在发病机制中起主要作用，因此其鉴定对诊断至关重要。EBV编码小RNA（EBER）流式荧光原位杂交（FISH）结合多色流式细胞术可高灵敏检测EBV感染细胞，即使样本有限。然而，EBER flow FISH劳动密集且需要技术专长，限制其在常规机构中的应用。研究人员调查本部门所用技术能否在其他机构成功实施。研究人员在本部门（机构A）对来自7例诊断为EBV相关疾病患者的冷冻保存外周血单个核细胞（PBMC）样本进行EBER flow FISH。随后在机构B进行相同检测，并比较细胞群体及每个群体内EBER阳性细胞频率的结果。两机构在细胞组分比例和EBER阳性细胞比例方面均观察到显著相关性。在两机构均检测到≥5% EBER阳性细胞的数据点中，8个数据点有6个（75%）位于±20%接受区间内。尽管一名EBER阳性细胞比例非常低的患者显示不一致结果，总体结果在两机构间无显著差异。尽管需要在更大规模多中心研究中进一步验证，这些发现提示初步的实验室间可比性，并支持EBER flow FISH跨机构潜在可转移性。

研究背景方面，Epstein–Barr病毒（Epstein–Barr virus，EBV；EB病毒）主要感染上皮细胞和B细胞，多数感染无症状或仅轻度症状，但EBV偶尔可感染T和/或NK细胞，导致EBV相关噬血细胞性淋巴组织细胞增生症（EBV-associated hemophagocytic lymphohistiocytosis，EBV-HLH）、种痘水疱病样淋巴增殖性疾病、严重蚊叮咬过敏和慢性活动性EBV病（chronic active EBV disease，CAEBV）等。上述疾病中特定EBV感染细胞直接参与发病机制，造成治疗困难；近期CAEBV综述强调诊断和预后依赖准确识别EBV感染细胞亚群，但缺乏标准化且广泛可及的检测方法。传统EBV检测包括PCR（polymerase chain reaction，聚合酶链反应）定量EBV DNA和酶联免疫吸附试验或免疫荧光检测病毒蛋白，但不能确定携带EBV的细胞群体；分选后qPCR可推断谱系，但劳动密集且受分选纯度和细胞丢失影响。EBER原位杂交（in situ hybridization，ISH）敏感，但识别感染细胞需双染，操作繁琐且可能降低敏感性。EBER flow FISH自20世纪90年代起被探索，结合多色流式可同时评估EBV负荷、细胞谱系和表型，但劳动密集且需技术专长，限制常规开展。研究人员此前已报道EBER flow FISH可在EBV相关疾病中识别EBV感染细胞，但扩大机构可及性是临床优先事项，因此本研究检验具备流式细胞术专长的机构能否复现其结果。

关键技术方法方面，样本为机构A本部门7例疑似EBV相关疾病患者的冷冻PBMC，患者年龄和疾病诊断见表1所列特征，其中4例另有外周血EBV DNA水平作为基于DNA的确认结果；同一批样本先在机构A分析，后在机构B复检。采用EBER flow FISH，以Alexa Fluor 647偶联EBER探针检测细胞内EBER，并结合多色流式表面染色区分CD3⁺ T、CD4⁺ T、CD8⁺ T、CD19⁺ B和CD16/CD56⁺ NK细胞；以RPL13A为阳性对照、DapB为阴性对照定义EBER阳性门；两机构使用不同抗体、流式细胞仪（BD LSR Fortessa X-20与FACSAria II SORP）及操作者，数据均用FlowJo分析；每样本最小可接受输入为1×10⁶细胞，>0.1%总淋巴细胞作为生物学有意义EBER阳性阈值。上述方法概括约250字以内。

研究结果方面，3.1 T、B、NK细胞亚群：尽管两机构使用不同单克隆抗体、仪器、仪器设置和技术人员，细胞亚群比例仍显著相关（r=0.9608，p<0.0001），说明多色流式在不同实验设置下可准确、可重复地测定主要细胞亚群比例。3.2 各群体中EBER阳性细胞比例：研究人员量化各亚群EBER阳性细胞占总淋巴细胞的百分比；患者6的代表性流式图显示两机构结果一致；患者2中机构A报告CD3⁺、CD4⁺、CD8⁺和CD16/CD56⁺细胞EBER阳性比例为0.2–2.9%，而机构B在这些亚群未检出EBER阳性细胞；其余患者两机构识别出的阳性细胞比例大体一致；患者4的CD16/CD56⁺组分表面抗原表达降低，需调整常规门控策略。两机构各细胞组分EBER阳性比例显著相关（r=0.6095，p=0.0001）；以机构B/机构A×100（%）计算相对差异，在两者均≥5%的8个数据点中，6个（75%）位于预设±20%接受区间内，2个超过该阈值。为进一步区分数据分析差异，机构B获取的原始流式数据由机构A技师独立再分析，并与机构B技师原分析比较；该分析者间比较的Spearman相关系数为0.8520，高于原机构间比较的r=0.6095，提示门控变异仅对总体变异有 modest 贡献；在≥5%的8个数据点中，分析者间比较全部位于±20%接受区间内，而原机构间比较为6/8（75%）。这些结果提示，机构间EBER阳性比例差异主要来自样本制备和数据采集，而非门控或数据分析。

讨论部分总结：传统EBER ISH和分选后qPCR存在准确性受限等问题，而EBER flow FISH可高敏检测EBV感染细胞，即使样本量小，但需高技能技术人员，限制应用。尽管抗体组合、流式细胞仪、仪器设置和技术人员不同，主要细胞亚群比例高度相关；两机构识别的EBV感染细胞群体大多一致，除患者2外。患者2的不一致可能与使用冻存复苏细胞有关，冻存时间或复苏后细胞活力差异可能影响可分析活细胞数，从而影响低比例EBER阳性群体的检测；低阳性时检测更易受分析前变异影响，新鲜标本可能减少此类变异并改善低阳性病例的机构间一致性。多数病例中同一EBER阳性细胞群体被识别，但比例存在差异，说明EBER flow FISH可重复识别EBV感染细胞谱系，但感染细胞比例的定量估计可能在机构间不同；75%的细胞亚群EBER阳性比例在两机构几乎相同，剩余25%虽识别同一阳性群体但比例不同。同一原始数据由两名分析者独立分析后相关系数提高且全部一致，提示机构间差异主要归因于样本制备和数据采集，而非门控或数据分析；EBER flow FISH包含移液、离心、去上清、避光温控孵育等多个手工且技术要求高的步骤，自动化可能减少操作者依赖变异，统一抗体 panel、流式细胞仪及仪器设置和数据分析流程可能进一步改善实验室间重复性和标准化。另一个考虑是EBV相关肿瘤性NK细胞已知CD16表达低至零，患者4肿瘤转化可能改变细胞表面抗原表达谱，提示需逐例仔细评估门控策略。EBER flow FISH的有效性也得到既往研究基于DNA的正交确认支持，且本研究中4/7患者有基于DNA的确认结果。局限包括患者数少、所有分析均使用冻存样本且未与新鲜标本直接比较，需更大队列和新鲜临床样本验证重复性和临床效用。

研究结论翻译：在两家独立机构进行的EBER flow FISH，尽管抗体组合、流式细胞仪、仪器设置和执行检测的技术人员存在差异，仍获得合理可重复的结果。尽管研究本应扩展至更大数量标本以确保更可重复的数据，但由于研究期结束和试剂盒销售临时暂停而未实现。尽管如此，这些发现建立了初步的实验室间可比性，并为EBER flow FISH更广泛临床实施的多中心验证提供基础。