基于便携式SERS-LFIA的预浓缩水样中嗜肺军团菌（Legionella pneumophila）定量筛查

《Talanta》：Quantitative screening of Legionella pneumophila in preconcentrated water samples using a portable SERS lateral-flow immunoassay

　　

拉曼编码侧向流免疫分析（lateral-flow immunoassay, LFIA）用于筛查预浓缩水中的嗜肺军团菌（Legionella pneumophila）。金纳米星（gold nanostars）表面增强拉曼散射（surface-enhanced Raman scattering, SERS）标签使视觉检测阈值降低3个数量级。在条件化洗脱液中，操作定量限（limit of quantification, LoQ）为1.6 × 10³ 培养当量菌落形成单位（colony-forming units, CFU）/L。对57份样品的盲法检测显示与培养法的分类一致率为89.5%。在10³ CFU/L时，相对灵敏度和相对特异性分别为92.3%和100%。

嗜肺军团菌（Legionella pneumophila）是机会性水源致病菌，也是军团病的主要病原，该病为与饮用水网络、冷却塔、热水回路及其他建筑相关基础设施等污染水系统相关的重症肺炎。尽管军团菌属可天然存在于淡水环境，但工程水系统中生物膜形成、水力停滞、热波动和消毒效力下降等条件可促进其持续存在和增殖，并偶发释放至水体；传播主要经吸入污染气溶胶，因此在细菌生长与气溶胶产生可能共存的设施中监测尤为重要。欧洲已知血清群病例中，血清群1（serogroup 1, SG1）占比最高，在一项大型欧洲监测研究中占91.3%，故其快速检测对风险导向水监测具有相关性，但仍需覆盖其他血清群和菌种。法规框架（如西班牙Royal Decree 487/2022及经Royal Decree 614/2024修订）和國際指南强化了及时监测需求；由于法规行动水平可能针对可培养军团菌属且随设施类型变化，靶向L. pneumophila的抗原检测应作为补充筛查方法，而非直接替代法规检测。培养法仍是参考方法，可提供可培养活菌信息并支持确认性微生物表征，但需样品浓缩、预处理、选择性培养基、受训人员和长时间孵育，结果常需数日；培养计数还可能因细胞进入活的非可培养状态或基质、竞争微生物、消毒剂残留和处理变异影响恢复而低估。qPCR等快速方法可缩短时间并提供基因组单位/L的定量结果，但基因组单位与可培养计数关系依赖基质和处理条件，非活细胞核酸可干扰解释。常规比色侧向流免疫分析低成本、易用、便携，但多限于定性或半定量，环境水监测所需分析灵敏度常不足。SERS可通过报告分子选择性光谱读出替代视觉判读，提供高分析灵敏度和光谱选择性，金纳米星等等离激元纳米标签可将视觉读条转化为定量平台；然而其整合入定量LFIA仍受膜传输、免疫识别、非特异滞留和信号重复性影响，需协同优化纳米标签、识别系统、条结构、样品制备和拉曼采集。研究人员据此评估一种用于预浓缩水样中L. pneumophila SG1的拉曼编码LFIA，将联苯-4-硫醇（biphenyl-4-thiol, BPT）编码金纳米星（gold nanostars, AuNSt）、夹心免疫识别和便携拉曼读出结合，并以自然污染水样洗脱液进行盲法、培养参照评估，旨在建立面向决策的快速筛查工具，培养法仍作为确认性微生物参考。

关键技术方法方面，研究人员采用AuNSt-BPT纳米标签（种子介导生长、BPT编码、两亲性聚合物封装）、被动抗体吸附制备检测 conjugate，以兔多克隆捕获抗体和鼠单克隆4CE4检测抗体构建夹心SERS-LFIA，采用HF90硝酸纤维素膜半条，并以785 nm便携拉曼读取BPT 1580–1595 cm^?1积分信号；水样经0.22 μm切向流微滤从1.0 L浓缩至50.0 mL条件化洗脱液（名义20倍体积浓缩）；57份预浓缩水样洗脱液由Actualia（Valencia, Spain）和Eurofins IPROMA提供；以ISO 11731培养为参考，在盲法条件下评估操作分类和定量一致性。

研究结果如下。3.1 AuNSt-BPT SERS纳米标签表征：通过透射电子显微镜（transmission electron microscopy, TEM）、紫外-可见消光光谱和SERS表征，发现AuNSt呈明确分支形貌，平均尺寸56 ± 8 nm（n = 103）；局域表面等离子体共振（localized surface plasmon resonance, LSPR）约775 nm，接近785 nm激发；BPT在约1084、1280和1590 cm^?1显示特征峰，其中1590 cm^?1（ν8a芳环伸缩）信噪比高且与硝酸纤维素背景重叠小，被选为定量分析信号；三批独立制备及4 °C储存一个月后主要光学性质基本保持，支持纳米标签制备重现性和短期光学稳定性。3.2 抗体功能化：通过被动吸附并逐步优化缓冲液和抗体浓度，发现100 mM硼酸盐缓冲液pH 8.5可保持悬浮稳定、BPT SERS响应和侧向流迁移，较低pH磷酸盐缓冲液出现聚集，pH 9.0硼酸盐缓冲液SERS响应变异较大（相对标准偏差（relative standard deviation, RSD）>20%），选定条件下RSD<10%；抗体浓度从10增至30 μg/mL使控制线强度由0.38 ± 0.06升至1.00 ± 0.08，40 μg/mL无比例增加（1.05 ± 0.12），故选30 μg/mL。3.3 SERS-LFIA格式配置：通过比较检测/捕获抗体配对、硝酸纤维素膜和捕获抗体浓度，发现Ab1同时作检测和捕获抗体时在10⁸ CFU/L无检测线信号，Ab2作捕获抗体、Ab1作检测抗体可恢复夹心形成，10⁸ CFU/L时检测线强度0.60 ± 0.09（n = 3），阴性<0.10 ± 0.02；HF90膜信号最高，Ab2 0.6 mg/mL在检测线强度、非特异背景和试剂消耗间最有利；半条储存3个月检测线和控制线SERS响应变化<10%。3.4 分析性能：通过PBS-T空白和10²–10⁸ CFU/L标准评估，视觉判读仅在≥10⁶ CFU/L可见检测线，而检测线区域二维SERS映射可在低约3个数量级显示浓度依赖积累；BPT峰面积随浓度增加，加权二次校准的加权决定系数（R²）为0.9996、校正加权R²为0.9994，留一浓度水平交叉验证预测误差为0.205 SD；空白均值17,709 a.u.（SD 682 a.u.），操作LoQ阈值为24,529 a.u.，反演得LoQ 3.20 log₁₀培养当量CFU/L，约1.6 × 10³ CFU/L条件化洗脱液；检测限（limit of detection, LoD）低于拟合模型最小响应，报告为<2.00 log₁₀ CFU/L（<100 CFU/L）且不外推；批内条间RSD<8%；选择性实验中，SG1 10⁶和10⁵ CFU/L产生响应，仅含非靶军团菌的Mix 1信号显著较低，含SG1 1.7 × 10⁵ CFU/L的Mix 2信号接近SG1 10⁵ CFU/L，回收约89%；同抗体对酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）显示SG1空白校正吸光度1.120，非靶菌为0.013–0.122，支持SG1优先识别，但不能排除残留交叉反应；上述LoD/LoQ为PBS-T操作阈值，非环境水基质特异值。3.5 水样分析与参考方法一致性：通过对57份预浓缩水样洗脱液（冷却塔水18、蒸发冷凝水8、管网水10、卫生热水/冷水15、天然水6）进行盲法SERS-LFIA与培养比较，发现所有洗脱液面积均超过缓冲液阈值19,755 a.u.，提示基质相关基线贡献，故该阈值不能单独作为基质阳性筛选标准；30份样品≥操作LoQ 24,529 a.u.，27份低于LoQ；30份可定量样品SERS-LFIA浓度3.44–7.52 log₁₀培养当量CFU/L条件化洗脱液；SERS-LFIA与参考方法在四类操作分类中51/57一致（89.5%），线性加权Cohen κ为0.928，6份不一致样品W2、W22、W26、W31、W46、W52均仅相邻一类；在预设原水当量阈值≥10³ CFU/L（洗脱液≥2.0 × 10⁴ CFU/L）的二分类分析中，得真阳性24、真阴性31、假阴性2、假阳性0，相对灵敏度92.3%（95%置信区间（confidence interval, CI）74.9–99.1%）、相对特异性100%（95% CI 88.8–100%）、阳性预测值100%（95% CI 85.8–100%）、阴性预测值93.9%（95% CI 79.8–99.3%）、总一致率96.5%（95% CI 87.9–99.6%）、Cohen κ 0.929；30份≥LoQ样品Bland-Altman分析平均差0.039 log₁₀ CFU/L（SD 0.383），95%一致性限?0.711至0.790 log₁₀ CFU/L，回转换平均SERS-LFIA/参考浓度比约1.09，一致性限对应约0.19–6.16；22/30份绝对差≤0.5 log₁₀ CFU/L，24/30份操作分类一致，20/30份同时满足分类一致和绝对差≤0.5 log₁₀ CFU/L；结果支持其用于预浓缩水样洗脱液的快速决策导向筛查，但小平均偏差不表示个体样品可互换定量，且两法测量生物学量不同（培养计数可培养活菌，抗体识别SG1脂多糖O抗原还可能响应活的非可培养、受损、非活但保留抗原细胞或抗原物质）。3.6 与代表性L. pneumophila检测方法比较：通过比较样品制备、分析时间、分析性能、便携性和验证设计，研究指出本工作的区别性贡献在于对自然污染水样进行盲法、培养参照评估，而非仅比较分析检测限；方法结合抗体识别、便携拉曼读出和高于明确缓冲液操作LoQ的浓度估计；局限包括需外部样品预浓缩、依赖缓冲液而非基质特异分析阈值、长期功能稳定性仍需研究、抗体表面覆盖和脱附稳定性的直接理化表征仍需开展，故应视为快速筛查和样品优先级排序工具，而非培养法替代；高于PBS-T操作LoQ的浓度估计在建立基质特异定量性能前对环境水样仍属探索性。

讨论部分总结：该研究支持SERS-LFIA作为预浓缩环境水样中L. pneumophila SG1的快速、面向决策的筛查工具，在预设阈值下显示良好相对灵敏度和特异性及较高分类一致性；但个体浓度估计的95%一致性限较宽，且培养与抗原识别所测生物学量不同，因此不能将小平均偏差解释为个体样品可互换定量。培养法仍是确认性微生物参考，用于确定性定量、法规决策及接近操作阈值结果。研究结论（翻译）：研究人员开发并评估了一种便携式SERS-LFIA，用于预浓缩环境水样中L. pneumophila SG1的快速筛查。通过结合BPT编码金纳米星、夹心免疫识别和便携拉曼检测，该 assay 实现了超越传统视觉条带判读的定量、报告分子选择性读出。本工作的主要贡献在于将这一分析方法转化为面向决策的筛查策略，并得到自然污染水样盲法、培养参照评估支持。纳米标签功能化、抗体配对、膜传输和拉曼采集的优化使缓冲液中操作LoQ达到1.6 × 10³培养当量CFU/L，约比同一侧向流 assay 的视觉检测阈值低3个数量级；批内条间变异<8%，支持所评估条件下分析读出的重复性。在57份环境水样分析中，SERS-LFIA在四个预设操作类别中与培养法一致率为89.5%，在预设名义原水当量阈值10³ CFU/L下二分类一致率为96.5%，相对灵敏度92.3%、相对特异性100%。对30份高于操作LoQ的样品，与培养法平均差为0.039 log₁₀ CFU/L，但95%一致性限（?0.711至0.790 log₁₀ CFU/L）显示个体浓度估计存在明显变异。这些结果支持该 assay 用于初步样品分类，而非可互换的定量计数。进一步开发应优先开展分析阈值和决策阈值的基质特异验证、扩展交叉反应测试、预浓缩回收率表征，以及抗体功能化纳米标签和组装 assay 的批间重现性和功能储存稳定性评估；端到端现场可行性仍待建立，因为水预浓缩、条洗涤和干燥以及光谱处理目前需要分开的工作流程步骤。总体而言，这些结果证明便携式SERS-LFIA有潜力作为补充分析工具，用于环境水样快速、风险导向的优先级排序，同时保留培养法用于确认性微生物分析和法规解释。