超分子增强适配体-HCR水凝胶微针平台（SEA-MN）用于皮肤间质液褪黑素原位监测

《Supramolecular Materials》：Supramolecular Hydrogel Microneedle Platform for In Situ Melatonin Monitoring

　　

超分子相互作用——包括主客体包合和核酸自组装——为设计功能材料提供了可逆且特异的识别基序。研究人员报道了一种超分子增强适配体-HCR微针平台（SEA-MN），该平台将β-环糊精（β-CD）主客体化学与杂交链式反应（HCR）自组装整合于甲基丙烯酰化透明质酸/聚乙二醇二丙烯酸酯（HAMA/PEGDA）水凝胶中。SEA-MN通过“微针取样、体外孵育、荧光读取”流程实现对皮肤间质液（ISF）中褪黑素的高灵敏检测。β-CD的引入不仅通过疏水腔包合将褪黑素富集效率提高2.63倍，还优化了水凝胶网络的溶胀动力学（平衡溶胀率181.20%）和机械强度（断裂力约0.8 N/针）。预封装于微针中的可触发适配体在靶标结合后发生构象转换，启动HCR级联——这是一种动态超分子自组装过程，可产生指数级荧光放大。该平台无需样品前处理，检测限低至10 pM，并表现出优异的选择性和生物相容性。在活体大鼠模型中，该传感器准确捕捉了褪黑素的昼夜节律波动，且结果与ELISA和LC-MS/MS高度相关（R² > 0.95）。本研究确立了一种用于生理环境中疏水性生物标志物微创监测的超分子材料设计策略。

褪黑素是松果体分泌的吲哚胺类激素，受视交叉上核调控并呈现明显昼夜节律，是评估内源性昼夜节律和睡眠质量的核心生物标志物。其生理浓度处于皮摩尔（pM）水平，且需在结构相似的吲哚类干扰物存在下实现高选择性识别，定量分析面临两大挑战。传统色谱法、免疫分析及液相色谱-串联质谱（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）等方法分别存在前处理复杂、低浓度准确性有限、仪器成本高等局限。皮肤间质液（skin interstitial fluid，ISF）与血浆小分子组成高度相关且无血细胞，是微创诊断的理想替代基质。水凝胶微针可实现采样与传感集成，但现有平台面临亲水网络对疏水性分析物富集效率低、平衡态单分子识别灵敏度不足等瓶颈。为此，研究人员提出超分子设计策略：将β-环糊精（β-cyclodextrin，β-CD）引入甲基丙烯酰化透明质酸/聚乙二醇二丙烯酸酯（methacrylated hyaluronic acid/poly(ethylene glycol) diacrylate，HAMA/PEGDA）水凝胶，利用其疏水腔通过主客体包合富集褪黑素；同时将可触发适配体-杂交链式反应（aptamer-hybridization chain reaction，Apt-HCR）级联系统预封装于微针中，通过靶标诱导构象转换启动指数级荧光放大。研究人员将该平台命名为超分子增强适配体-HCR微针平台（SEA-MN），并验证其在“微针取样-体外孵育-荧光读取”流程中的性能。

主要技术方法方面，制备上采用模塑法和紫外（ultraviolet，UV）光交联制备HAMA/PEGDA/β-CD复合水凝胶微针，以纯HAMA和HAMA/PEGDA为对照；用扫描电子显微镜（scanning electron microscopy，SEM）、万能材料试验机、溶胀实验和傅里叶变换红外光谱（Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR）表征其性能。在均相溶液中优化Apt-HCR条件，并在2%琼脂糖模拟皮肤模型中验证穿刺、取样、原位反应与定量线性。活体实验使用6周龄Sprague Dawley（SD）大鼠（购自Spefford（北京）生物技术有限公司，生产许可证号SCXK（京）2024-0001），光暗周期适应14天后于六个时间点应用微针并同步采血，以酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）和LC-MS/MS为参照；CCK-8法（Cell Counting Kit-8）和H&E染色（hematoxylin and eosin staining）评价生物相容性。

3.1 β-CD/HAMA/PEGDA水凝胶微针的理化表征
扫描电镜显示微针为规则锥形阵列，高度约800 μm，基底直径约300 μm。力学测试表明，HAMA/PEGDA/β-CD配方的断裂力约0.8 N/针，高于纯HAMA和HAMA/PEGDA组，归因于PEGDA共价交联与β-CD外围羟基形成的物理交联共同构成化学-物理双交联网络。溶胀实验显示30 s交联样品平衡溶胀率为181.20%，且保持83.9%的高度保留率。LC-MS/MS定量显示含β-CD微针的褪黑素摄取量为不含β-CD组的2.63倍，FTIR证实β-CD与褪黑素形成氢键网络，证明β-CD作为“分子收集器”的富集作用。

3.2 适配体-HCR传感系统的体外分析性能
在均相溶液中，外源触发链可启动HCR，荧光随时间上升并在120–150 min达到平台；靶标浓度梯度实验显示荧光呈剂量依赖性增加，而仅含原始适配体的对照组无信号，证明靶标诱导构象转换机制可行。优化后条件为MT-A适配体50 nM、H1/H2发夹探针各50 nM、20–25°C、150 min。该条件下，系统在10 pM至100 nM范围内呈良好剂量-响应关系，四参数Logistic拟合R²=0.9936，检测限（limit of detection，LOD）约10 pM，定量限（limit of quantification，LOQ）为100 pM；关键浓度重复测试相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）均<12%。生理浓度干扰物实验显示，L-色氨酸、5-羟色胺、5-甲氧基色胺、多巴胺及N-乙酰血清素（N-acetylserotonin，NAS）在生理浓度下均不产生明显非特异信号，而100 pM褪黑素产生强信号，表明特异性优良。该适配体序列来源于Pundir等人报道的截短适配体MLT-A-2F。

3.3 模拟皮肤模型中的体外性能验证
微针可顺利刺入2%琼脂糖模拟皮肤且无弯曲断裂；含褪黑素凝胶组针体产生显著FAM荧光，平均荧光强度（mean fluorescence intensity，MFI）为空白组7倍以上。探针释放实验显示60 min内累计释放率仅约3%，UV交联和干燥处理后探针仍保持HCR活性。在0–400 pM浓度范围内，针体MFI与褪黑素浓度呈线性关系（Y=789.6X+5000，R²=0.9994），各浓度点变异系数（coefficient of variation，CV）<10%。干扰物实验中，各干扰组信号与空白无显著差异，100 pM褪黑素组信号为干扰组的3倍以上，NAS仅在远超生理水平时产生极弱信号。

3.4 体内验证结果
在SD大鼠六个时间点应用微针后，暗相（02:00）回收微针的荧光强度显著高于光照相（14:00），与褪黑素昼夜节律一致。利用体外标准曲线将荧光转换为ISF浓度后，微针传感器结果与ELISA和LC-MS/MS结果高度相关（R² > 0.95），且三种方法测得的昼夜波动特征一致。生物相容性方面，CCK-8实验显示HaCaT细胞相对活力>95%且略高于对照组，H&E染色显示穿刺通道均匀微创，无水肿、出血、坏死或炎症浸润，穿刺后5 min内伤口基本闭合。

讨论部分指出，当前SEA-MN仍需约60 min体外孵育完成信号读取，未来可通过引入更高效的核酸扩增策略（如催化发夹组装）或优化微针几何结构，并开发便携式荧光检测装置来缩短时间；ISF与血浆褪黑素浓度的换算关系可能因个体皮肤差异而波动，后续临床转化需建立更全面的人群校准模型。研究结论可概括为：本研究成功开发了集成可触发适配体-杂交链式反应信号放大系统的β-CD/HAMA/PEGDA复合水凝胶微针平台（SEA-MN），通过超分子材料设计克服了现有水凝胶微针检测疏水低丰度小分子的关键瓶颈。β-CD将褪黑素富集效率提高2.63倍，并优化了水凝胶溶胀与力学性能；Apt-HCR在靶标诱导下启动指数级荧光放大，在严格干扰下仍具优异特异性；在活体大鼠模型中准确捕捉褪黑素昼夜节律，与ELISA和LC-MS/MS高度一致（R² > 0.95）；CCK-8和H&E结果证实其良好生物相容性与微创安全性。该设计策略通过替换特异性适配体序列，有望扩展至类固醇激素、脂溶性维生素等其他低丰度疏水性生物标志物的可穿戴微创动态监测，为个性化精准医学和数字健康管理提供通用器件化解决方案。