基于CRISPR-Cas14a1的电化学生物传感器，采用三元MXene/COF/Au界面和四面体DNA探针，用于快速检测Ichthyophthirius multifiliis（多子小瓜虫）

《Sensors and Actuators B: Chemical》：CRISPR-Cas14a1-powered electrochemical biosensor with ternary MXene/COF/Au interface and tetrahedral DNA probe for rapid detection of Ichthyophthirius multifiliis

【字体：大中小】 时间：2026年11月03日 来源：Sensors and Actuators B: Chemical 7.7

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　　 • 用于检测Ichthyophthirius multifiliis的CRISPR-Cas14a1电化学生物传感器 • 三元MXene/COF/Au界面和MB-TDN探针实现双重信号增强 • 在8个数量级的宽线性范围内，检测限极低，为1.36个拷贝/μL

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用于检测Ichthyophthirius multifiliis的CRISPR-Cas14a1电化学生物传感器
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三元MXene/COF/Au界面和MB-TDN探针实现双重信号增强
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在8个数量级的宽线性范围内，检测限极低，为1.36个拷贝/μL
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30分钟的一锅法ERA–Cas14a1反应时间，与qPCR高度一致（r = 0.9639）
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基于Cas14a1的电化学传感器，用于检测鱼类寄生虫的双链DNA（dsDNA）

引言

Ichthyophthirius multifiliis（简称I. multifiliis）是一种纤毛原生动物寄生虫，会感染淡水鱼和两栖动物的皮肤和鳃，导致白点病。这种疾病的宿主范围广泛，传播速度快，死亡率高，对全球淡水水产养殖业造成了严重的影响[1]、[2]。目前的主要控制措施——物理隔离、化学治疗和疫苗接种——大多是反应性的，因为感染通常在出现可见临床症状后才会被诊断出来，从而错过了有效干预的窗口[3]。传统的诊断方法，包括皮肤刮片的显微镜检查、基于PCR的检测和免疫学测试，要么对早期检测不够敏感，要么需要实验室基础设施和受过培训的人员，要么存在交叉反应的问题[4]、[5]、[6]。这些局限性凸显了迫切需要一种快速、灵敏且可在现场使用的诊断平台来应对这种病原体。

最近，成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）和CRISPR相关（Cas）系统作为核酸检测的变革性工具出现了，其中Cas12a和Cas13a能够实现高度特异性的目标识别，并伴随单链DNA（ssDNA）或RNA的切割[7]。在这些工具中，Cas14a1是一种微型V型CRISPR效应蛋白（约530个氨基酸），它具有独特优势：在目标识别时表现出高保真的ssDNA切割活性，并且体积约为Cas12a的一半，便于集成到微型生物传感设备中[8]、[9]。然而，早期感染时目标核酸的丰度较低，限制了单独使用Cas14a1的检测灵敏度。为了克服这一问题，引入了等温酶促重组扩增（ERA）来预扩增目标[10]，而单导向RNA（sgRNA）工程的最新进展将Cas14a1的识别范围扩展到了双链DNA（dsDNA）目标[10]、[11]，使其能够应用于更广泛的病原体检测中。

电化学生物传感器响应迅速，操作简单，且兼容便携式仪器设备，因此非常适合进行现场检测[12]。将CRISPR的特异性与电化学读数结合，使得核酸检测变得迅速。然而，要将这一潜力转化为可靠的现场可部署传感器，关键在于合理的电极界面设计，以实现信号转导和探针稳定性的最大化[13]。迄今为止，大多数电化学CRISPR（E-CRISPR）传感器依赖于简单的电极修改或传统的ssDNA报告分子，这往往导致灵敏度有限、重复性差以及在真实样本中稳定性不足。因此，仍然需要一种能够同时增强电子转移、实现高密度探针装载，并为结构明确的探针提供可靠锚定的接口架构。

为了解决这些挑战，我们采用了一种双层策略。在界面层，使用三元纳米复合材料，将Nb₄C₃-MXene作为导电支架，具有优异的导电性和较大的表面积[14]、[15]；氮掺杂的石墨烯-聚乙烯亚胺-共价有机框架（NG-PEI-COF）作为功能性修饰剂，引入探针 immobilization 的活性位点并提高亲水性[16]、[17]；珊瑚状金（CFAu）作为导电桥梁，减少电荷传输阻力并通过Au-S键锚定巯基化探针[18]、[19]。这三种组分的协同作用预计会显著扩大电化学活性表面积，并为后续的生物识别事件奠定高信噪比的基础。在信号报告层面，我们引入了经过亚甲蓝标记的四面体DNA纳米结构（MB-TDN）作为Cas14a1的底物。与传统的线性ssDNA报告分子不同，刚性的TDN框架可以确保明确的空间定位，并最小化非特异性信号波动，而其四个顶点上的MB标记产生的初始电流强且稳定[20]、[21]、[22]。在目标识别后，ERA扩增的I. multifiliis DNA激活Cas14a1的切割作用，特异性地破坏MB-TDN的突出部分，释放MB标签并产生浓度依赖的信号变化。

这项工作做出了三个关键贡献。首先，它将基于Cas14a1的电化学检测扩展到双链DNA目标，用于水生动物病原体的检测。其次，它证明了三元界面同时增强了电子转移，提高了探针装载能力，并为结构明确的探针提供了可靠的锚定，解决了传统E-CRISPR电极界面的关键限制。第三，它确立了MB-TDN作为有效的Cas14a1切割底物，为其他基于CRISPR的电化学检测提供了新的探针设计原理。通过系统优化和临床验证，该集成系统实现了与定量PCR（qPCR）相当的定量准确性，且反应时间为30分钟的一锅法ERA–Cas14a1。这使得该传感器成为现场监测I. multifiliis的实用工具，并为新兴水生动物病原体的可编程检测提供了蓝图。

部分摘要

核酸片段的制备

用于组装TDN支架的四种结构寡核苷酸（S1–S4）（见图S1和表S1）是使用NUPACK网络工具设计的，并由Sangon Biotech（上海）有限公司合成的。为了构建用于电化学检测的MB-TDN探针，每条链都延长了22个核苷酸的胸苷（T22）突出部分，末端带有MB标签，从而为每个TDN提供了四个氧化还原标签。用于荧光切割检测的FQ-TDN探针也使用相同的S1–S4支架和T22

E-CRISPR生物传感器的工作原理

用于检测I. multifiliis的电化学生物传感器的设计和工作原理如图1所示。该传感器通过Nb₄C₃-MXene/NG-PEI-COF纳米复合材料、MB-TDN探针和ERA-Cas14a1系统的协同集成实现了级联信号放大。

结论

总之，我们开发了一种电化学生物传感器，该传感器集成了Nb₄C₃-MXene/NG-PEI-COF/CFAu三元界面和ERA-Cas14a1系统，能够快速灵敏地检测I. multifiliis。该传感器表现出优异的分析性能，包括1.36个拷贝/μL的检测限、八个数量级的宽线性范围，以及30分钟的一锅法ERA–Cas14a1反应时间（从模板到最终读数大约需要33–35分钟），并且与qPCR的高度一致性