《Sensors and Actuators B: Chemical》：CRISPR-Assisted Centrifugal Micro?uidic Chip for Multiplexed Point-of-Care Nucleic Acid Detection
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•实现被动流体控制，从而能够在离心盘上自动进行操作。•样品制备和CRISPR检测集成在一个封闭的平台上。•在25分钟内同时检测出六种呼吸道病原体。•检测灵敏度可达到每微升一份样本。•临床测试结果显示与实时荧光PCR完全一致。引言随着呼吸道病原体的传播增加，对快速准确地诊断传染病的
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实现被动流体控制，从而能够在离心盘上自动进行操作。
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样品制备和CRISPR检测集成在一个封闭的平台上。
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在25分钟内同时检测出六种呼吸道病原体。
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检测灵敏度可达到每微升一份样本。
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临床测试结果显示与实时荧光PCR完全一致。
引言
随着呼吸道病原体的传播增加，对快速准确地诊断传染病的需求也变得更加迫切[1]、[2]。病毒性和细菌性呼吸道感染常常具有重叠的临床症状，可能会同时发生，这使得针对特定病原体的诊断和治疗变得复杂。因此，需要能够同时识别多种病毒和细菌病原体的诊断平台，以便及时进行鉴别诊断[3]、[4]。实时聚合酶链反应（PCR）由于其高灵敏度和特异性，仍然是临床病原体检测的参考方法[5]、[6]、[7]。然而，它依赖于复杂的仪器设备、中心实验室、受过培训的人员以及相对较长的工作流程，这限制了在护理点（POCT）进行快速检测的可能性[8]。因此，便携式护理点检测平台可以在分散和资源有限的环境中支持及时的多重筛查[9]、[10]、[11]、[12]。
微流控平台通过结合受控的液体处理与等温核酸扩增，提供了一种微型化和多重化的POCT技术方案[13]、[14]、[28]。重组酶聚合酶扩增（RPA）和环介导的等温扩增（LAMP）可以在恒定温度下实现快速扩增，但非特异性扩增可能会影响分析的特异性[15]、[16]。CRISPR/Cas系统通过CRISPR RNA（crRNA）引导的序列识别，提供了第二个目标特异性验证步骤[17]、[18]。将等温扩增与CRISPR/Cas结合使用，从而实现了快速且灵敏的病原体检测[1]、[3]、[19]。我们之前的工作进一步开发了一种基于超快荧光的RPA-CRISPR检测方法，使用了Cas12a和Cas13a[25]。然而，将这种快速检测方法嵌入到多阶段的微流控工作流程中仍然具有挑战性，因为样品制备、反应转移和多重检测需要协调进行，而不能影响检测速度。许多基于CRISPR的检测方法还需要离芯片的核酸提取或手动产物转移，这增加了操作复杂性和气溶胶污染的风险[14]、[20]。一些微流控实现还依赖于辅助泵或主动驱动的阀门，从而使得封闭的样品到结果操作变得更加复杂。
离心微流控系统，也称为实验室-on-a-disc（LOAD）平台，利用旋转产生的力来通过预定义的微通道网络输送液体[21]、[24]。它们的分隔式架构支持顺序样品处理，同时限制了开放操作和交叉污染。最近的LOAD平台集成了被动试剂分配、样品裂解、核酸提取和等温扩增等功能
[29]。其他离心系统将自动化样品制备与多重分子检测或基于CRISPR的读出结合[23]、[30]。磁性调节也被用于LOAD工作流程中的试剂存储和顺序释放[32]。这些研究展示了在离心平台上进行自动化和多重分子检测的可行性。然而，一些复杂的工作流程仍然依赖于专用阀门的驱动、辅助控制组件或离芯片的样品制备程序[22]、[27]。许多报道的平台还仅针对单一病原体类别的目标进行检测，限制了病毒-细菌共感染的鉴别分析[22]、[27]。因此，剩余的挑战不仅仅是添加更多的检测模块，而是通过统一的旋转控制程序来协调核酸纯化、流体路由和多重检测。
为了解决这些问题，我们开发了一种用于检测病毒和细菌呼吸道病原体的离心微流控平台（图1a）。其核心设计是一种旋转编程的被动流体协调策略，通过改变旋转速度和方向来协调顺序样品处理和分配。这种策略减少了对辅助泵或单独驱动的流量阀的需求。一个可控的磁环模块被连接到旋转工作流程中，用于基于磁珠的核酸捕获、洗涤和按需释放。基于我们之前的超快荧光RPA-CRISPR检测方法，RPA和CRISPR/Cas12a试剂以冻干形式预加载在空间分离的芯片内反应室中。这种布置使得试剂可以在 chip 上存储，同时减少了手动试剂制备和开放产物转移的需要。在单次样品加载后，该集成平台在25分钟内完成了核酸处理和六种目标的病毒-细菌检测，并实现了每微升一份样本的检测限。这些进展共同建立了一个快速、封闭且操作简化的多重呼吸道病原体检测平台，凸显了其在资源有限环境中的应用潜力。
章节片段
芯片设计和制造
该微流控芯片使用SolidWorks设计，并通过精密CNC雕刻从聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）制成。芯片直径为120毫米，总厚度为5毫米（图S1）。用于试剂存储和顺序释放的毛细管阀门经过疏水处理，以获得约120°的接触角。使用双面压敏粘合剂进行层压和粘合。磁珠、 absorbent垫以及冻干的RPA和CRISPR试剂被放置在其中
芯片设计和自动化工作流程
我们开发了一种自动化的离心微流控平台，该平台利用编程的旋转控制来协调样品预处理、基于磁珠的核酸提取、RPA扩增和CRISPR/Cas12a检测。该平台在25分钟内完成了从样品到结果的整个工作流程，并能够区分检测病毒和细菌呼吸道病原体。芯片采用对称的多层结构，由聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）制成。每个单元包括
结论
我们开发了一种完全集成的离心微流控平台，结合了旋转编程的被动流体协调和芯片上的冻干超快RPA-CRISPR检测。编程控制的旋转速度和方向变化协调了顺序试剂释放、振荡混合、废物和洗脱液的路由以及六通道样品分配，无需辅助泵或单独驱动的流体阀门。一个电磁环进一步实现了基于磁珠的捕获功能
支持信息
在离心微流控操作期间，通过虹吸阀触发液体排放（视频S2）。
自动化全芯片流体操作过程的可视化（视频S3）。
材料和试剂；引物和crRNA序列；RPA/RT-RPA辅助的CRISPR/Cas12a检测；实时荧光定量PCR检测；RPA/RT-RPA和CRISPR/Cas12a试剂的冻干；芯片
CRediT作者贡献声明
Muzi Zhu：撰写——审稿与编辑，可视化。Yunyun Zhang：验证，数据管理。Jue Pan：研究，数据管理。Fei Hu：撰写——审稿与编辑，监督，资源获取，资金申请。Chao Li：撰写——初稿，可视化，方法学，研究，数据管理，概念化。Niancai Peng：监督，项目管理。Yang Li：验证，正式分析。Shuhao Zhao：撰写——审稿与编辑，可视化。Tianyi Zhang：撰写——
致谢
本研究得到了中国国家重点研发计划（2021YFC2400902）、国家自然科学基金（62375217）和陕西省青年科技明星创新能力支持计划（2024ZC-KJXX-050）的支持
赵超|胡飞|潘珏|张云云|朱慕姿|王兴成|张天一|赵绍浩|李阳|彭年才
