《Brain and Behavior》：Targeting Ninjurin-1-Mediated Microglial Pyroptosis Attenuates Neuroinflammation and Neuronal Injury Following Intracerebral Hemorrhage
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目的：本研究旨在阐明Ninjurin-1（Ninj1）在脑出血（intracerebral hemorrhage，ICH）后继发性神经损伤中的病理生理作用，并重点揭示其在微胶质细胞焦亡中的功能及其上游由核因子-κB（nuclear factor-kappa B
目的：本研究旨在阐明Ninjurin-1（Ninj1）在脑出血（intracerebral hemorrhage，ICH）后继发性神经损伤中的病理生理作用，并重点揭示其在微胶质细胞焦亡中的功能及其上游由核因子-κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB）介导的转录调控机制。
方法：研究人员首先通过计算机模拟转录组谱分析初步鉴定候选靶点。随后采用胶原酶诱导的小鼠ICH模型以及氯化血红素（hemin）刺激的微胶质细胞模型。利用靶向基因沉默技术（体内siRNA和体外shRNA）及药理学阻断方法对机制通路进行探究。通过免疫印迹、分子检测和组织病理学方法定量评估疾病表型——包括焦亡执行、神经炎症和继发性神经元死亡。上游调控架构通过染色质免疫沉淀-定量PCR（ChIP-qPCR）、电泳迁移率变动分析（EMSA）和双荧光素酶报告基因实验进行验证。
结果：生物信息学筛选表明Ninj1是ICH后显著上调的候选转录本，该发现在体内和体外出血模型中均得到证实。通过预防性体内靶点验证，Ninj1敲低可限制血肿周围水肿并保护感觉运动功能。在机制层面，抑制Ninj1可阻断微胶质细胞焦亡级联反应并减轻继发性神经毒性。此外，NF-κB被证明可转录激活NLRP3和Ninj1，尽管在ChIP-qPCR实验中，仅Nlrp3位点的启动子直接富集具有统计学显著性。
结论：Ninj1作为微胶质细胞焦亡的终端执行者以及ICH后神经炎症的关键放大器。在与NLRP3协同的NF-κB依赖性转录程序调控下，该信号轴加剧继发性脑损伤，使Ninj1成为神经保护靶点验证的可行分子候选。
脑出血（intracerebral hemorrhage，ICH）作为一种严重的出血性卒中亚型，可对中枢神经系统造成急性结构损伤，具有高死亡率、高致残率和高复发率的特点，构成重大全球公共卫生负担。当前临床干预以支持性措施为主，包括血压管理、降低颅内压和血肿清除等，但缺乏靶向药物治疗，患者预后往往不佳，其根本原因在于血肿及其毒性降解产物所诱发的继发性脑损伤（secondary brain injury，SBI）。因此，解析驱动继发性神经损伤的分子机制对于发现新型神经保护靶点具有重要意义。
在SBI进程中，小胶质细胞激活是神经炎症级联反应的核心驱动因素。在出血微环境中，活化的小胶质细胞可发生焦亡（pyroptosis）——一种促炎性程序性细胞死亡方式，其特征为质膜破裂及IL-1β等促炎细胞因子的大量外流，从而加剧局部组织炎症。NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3（NOD-like receptor family pyrin domain-containing 3，NLRP3）炎症小体在此过程中发挥关键介导作用，ICH后NLRP3激活可被中性粒细胞胞外诱捕网（neutrophil extracellular traps，NETs）等触发，促进焦亡并加重神经损伤。上游调控方面，NF-κB信号通路作为NLRP3的经典转录激活因子，可加剧炎症病理过程。尽管NLRP3炎症小体在启动小胶质细胞焦亡中的作用已有充分认识，但其末端下游执行阶段的具体调控机制仍不完全清楚。
Ninjurin-1（Ninj1）最初被鉴定为一种细胞表面黏附分子，经典研究集中于组织重塑和损伤后神经再生。然而近期研究揭示其在裂解性细胞死亡的末端执行阶段发挥关键作用：Ninj1被确认为质膜破裂的必要介导因子，可触发损伤相关分子模式（damage-associated molecular patterns，DAMPs）的胞外释放并放大炎症反应。在巨噬细胞焦亡中，Ninj1在Gasdermin D（GSDMD）成孔后协调细胞膜的最终解体，是细胞内容物外排的严格必要步骤。然而，其在ICH期间小胶质细胞焦亡中的潜在参与以及上游转录调控网络仍未阐明。
研究人员首先利用公共ICH数据集的转录组分析鉴定驱动急性神经炎症反应的关键候选基因，随后结合体外小胶质细胞模型和体内小鼠ICH模型，系统阐述了Ninj1对继发性神经损伤的具体贡献，明确其作为小胶质细胞焦亡末端执行者的功能特征及其受NF-κB信号轴的转录调控机制。研究结果表明：第一，Ninj1被鉴定为ICH后显著上调的候选转录本，在体内和体外出血模型中均呈现强诱导表达，且主要定位于活化小胶质细胞；第二，体外靶向沉默Ninj1可阻断血红素（hemin）诱导的小胶质细胞焦亡级联反应，抑制caspase-1和GSDMD的蛋白水解成熟，维护质膜完整性并减少炎症因子释放；第三，小胶质细胞焦亡介导的神经元损伤可通过Ninj1敲低得到有效缓解；第四，Ninj1的诱导并非完全依赖于NLRP3炎症小体激活，提示存在协调的上游调控框架；第五，NF-κB协调Ninj1和NLRP3的转录激活，尽管p65在两个启动子上的直接染色质结合特征存在差异；第六，体内靶向沉默Ninj1可减轻血肿周围水肿、抑制组织IL-1β蓄积、挽救神经元存活并改善感觉运动功能。
在关键技术方法方面，研究人员使用了多种技术手段。动物模型采用雄性C57BL/6小鼠（8–10周龄，22–25 g，n=96），通过立体定向注射0.0375 U IV型胶原酶至右侧基底节建立ICH模型，对照组注射等量生理盐水。研究从最初96只小鼠中最终纳入78只完成全部实验流程，排除率为18.75%。实验分组采用随机化方法，每组动物分配至两个平行队列：队列1（每组n=6）用于感觉运动功能评估（mNSS和Rotarod测试）及脑含水量测定；队列2（每组n=6）用于末端脑组织分析，其中3只经心脏灌注4%多聚甲醛进行组织学评估，其余3只不经灌注收集新鲜冷冻血肿周围组织用于分子检测。行为学评分和组织学定量由对实验分组不知情的研究者执行。体外模型采用BV-2小胶质细胞系（SCSP-5208，中国科学院细胞库）和HT22神经元细胞系（GCL-0697，武汉普诺赛），以100 μM hemin处理24小时构建体外出血模型；此外从出生后第1–3天（P1-P3）C57BL/6小鼠大脑皮层分离原代小胶质细胞以验证永生化细胞数据。生物信息学分析从基因表达综合（Gene Expression Omnibus，GEO）数据库获取GSE290311和GSE228222转录组数据集，以经校正的p值<0.05和|log2 fold change|>2作为差异表达基因（DEGs）筛选阈值，并进行GO和KEGG功能富集分析。靶向基因沉默采用体内siRNA（脑室内注射2 nmol）和体外shRNA转染；药物阻断使用MCC950（1 μM，NLRP3抑制剂）和BAY 11-7082（5 μM，NF-κB抑制剂）。分子检测包括蛋白质印迹（Western blot）、ELISA、LDH释放检测、流式细胞术、免疫荧光、TUNEL染色、尼氏染色、qRT-PCR；机制验证采用ChIP-qPCR、EMSA和双荧光素酶报告基因实验；微胶质-神经元相互作用通过Transwell非接触共培养体系评估。研究方案经湘雅医学院附属株洲医院动物伦理委员会批准（批准号K2025-01-223-412），并遵循ARRIVE指南。
研究人员首先通过生物信息学鉴定ICH中的候选靶分子和信号通路。对公共ICH小鼠模型转录组数据集进行整合再分析，主成分分析（PCA）显示样本沿PC1按生物学条件（ICH vs. sham）分离，沿PC2反映数据集间批次差异，证实存在稳健的疾病相关转录特征。采用严格筛选阈值后获得大量DEGs，其中Ninj1——一种与质膜破裂执行密切相关的分子——是最显著上调的候选基因之一。功能富集分析显示GO注释显著富集于"髓系白细胞激活""趋化性"和"吞噬作用"等条目，KEGG通路分析突出"吞噬体""溶酶体"及多个炎症相关信号网络，强有力地提示急性免疫级联反应的激活。
随后研究发现ICH后Ninj1在小胶质细胞中高表达。采用标准化体内小鼠ICH模型，术后72小时qRT-PCR和免疫印迹分析显示血肿周围微环境中Ninj1的转录本和蛋白水平较假手术对照组显著升高。双重免疫荧光标记结合共聚焦成像和定量荧光分布分析显示，Ninj1（红色荧光）与经典小胶质细胞标志物IBA1（绿色荧光）呈现显著的空间共定位。对独立公共单细胞RNA测序数据集（GSE282308）的进一步挖掘表明，Ninj1在髓系谱系群体中富集，在嗜中性粒细胞、活化巨噬细胞和小胶质细胞/巨噬细胞中呈现显著转录水平，而中枢神经系统驻留的非髓系细胞中表达可忽略不计。
在体外功能研究中，研究人员验证了Ninj1介导hemin诱导的小胶质细胞焦亡。在hemin刺激的BV-2细胞中实施shRNA介导的基因沉默，免疫印迹显示Ninj1抑制同时削弱caspase-1和GSDMD的蛋白水解成熟，质膜完整性得到维护，LDH和IL-1β外流减少。功能获得性拯救实验表明，Ninj1的外源重新导入可有效逆转sh-Ninj1诱导的上游caspase-1和GSDMD裂解抑制，支持正反馈环路调控上游炎症小体激活的假说。在原代小鼠小胶质细胞中，hemin诱导的Ninj1升高及caspase-1/GSDMD加工被靶向Ninj1敲低一致性地消除。
在神经元损伤评估中，研究人员采用hemin刺激的BV-2细胞条件培养基处理神经元。流式细胞术和免疫印迹结果显示，来自Ninj1敲低小胶质细胞的条件培养基有效降低神经元总体凋亡率，同时减少cleaved caspase-3的激活，证实Ninj1依赖性小胶质细胞焦亡是继发性神经元损伤的关键驱动因素。
研究人员进一步探讨了Ninj1诱导与NLRP3炎症小体激活的层级关系。选择性NLRP3拮抗剂MCC950预处理可削弱整体焦亡反应，减少caspase-1的蛋白水解成熟。然而值得注意的是，MCC950虽使hemin诱导的Ninj1蛋白水平出现部分但具有统计学意义的降低，Ninj1表达仍显著高于对照组。这种部分下调表明，Ninj1的初始诱导独立于NLRP3激活，但其持续上调可能通过裂解性细胞死亡及随后胞外炎症信号驱动的正反馈环路进一步放大。在平行共培养实验中，MCC950处理的小胶质细胞来源条件培养基赋予稳健的神经保护效应。
在转录调控机制方面，双荧光素酶报告基因实验显示NF-κB异位表达可增强含野生型Ninj1和NLRP3启动子区域报告构建体的荧光信号。ChIP-qPCR分析确认NF-κB p65亚基在BV-2细胞中富集于Nlrp3启动子位点，而Ninj1启动子处的p65富集未达统计学显著水平。EMSA-超迁移实验进一步证实了p65与相应启动子探针的特异性结合。在hemin刺激模型中，免疫荧光追踪显示p65核转位增强，该过程可被NF-κB拮抗剂BAY 11-7082选择性限制；免疫印迹证实BAY 11-7082可削弱hemin诱导的Ninj1和NLRP3蛋白同步升高。
在体内靶点验证中，ICH诱导前48小时预防性脑室内给予Ninj1靶向siRNA。行为学评估显示，Ninj1敲低显著保护整体神经功能和运动协调能力，表现为mNSS评分改善和转棒耐力提升。组织病理学评估表明，预防性基因敲低限制了血肿周围水肿的积累，抑制了IL-1β的组织过度蓄积，并挽救局部神经元群体，存活神经元密度显著恢复。分子水平上，免疫印迹证实ICH后总Ninj1和cleaved caspase-1的显著上调被该靶向遗传干预削弱。免疫荧光定位进一步显示，IBA1阳性髓系细胞（包括小胶质细胞和巨噬细胞）内Ninj1和cleaved GSDMD的强烈诱导在体内Ninj1敲低后被显著消除。
讨论部分指出，ICH以血肿诱导的SBI为主要驱动因素，失调的神经炎症是脑水肿和不可逆神经元丢失的核心催化剂。Ninj1最初被表征为神经系统的黏附分子，参与发育和再生过程，但近期文献揭示其在加剧无菌性炎症中的有害功能：靶向缺失或抑制Ninj1可通过阻止细胞溶解对急性肝衰竭和肾损伤具有保护作用。本研究将这一概念延伸至ICH病理环境，证实Ninj1是小胶质细胞焦亡的末端执行者，同时是神经炎症级联的关键放大器。关于上游调控，NF-κB作为经典"信号1"协调NLRP3和Ninj1的转录激活。虽然ChIP-qPCR中p65对Nlrp3启动子的直接富集具有统计学显著性，但双荧光素酶和EMSA验证支持p65对两个启动子的转录激活潜能，提示存在协调且可能间接的调控网络。此外，拯救实验支持Ninj1与上游炎症小体激活之间存在正反馈联系：通过阻断Ninj1依赖性膜破裂，DAMPs（特别是HMGB1）的胞外泄漏受到限制，从而打断了自分泌/旁分泌扩增环路，减弱NLRP3的持续过度激活。研究人员据此提出，Ninj1介导的膜破裂不仅是细胞死亡的末端事件，更是神经炎症级联的关键放大器。
研究结论可翻译为：本研究阐明了NF-κB/Ninj1信号级联对ICH后继发性神经损伤的重要贡献。利用互补的体内小鼠模型和体外实验体系，研究结果表明NF-κB转录因子调控NLRP3和Ninj1两者的表达以调节小胶质细胞焦亡程序，尽管p65在这些靶启动子上的物理结合动力学存在差异。研究人员同时承认若干局限性：首先，脑室内siRNA给药和IBA1免疫染色缺乏绝对细胞类型特异性，体内神经保护效应属于髓系谱系的一般性验证而非小胶质细胞特异性沉默；其次，观察仅限于出血后急性病理窗口（72小时），Ninj1在慢性炎症、长期组织重塑和神经修复中的时间动态有待全面表征；第三，永生化BV-2和HT22细胞系虽为初步机制筛选提供稳健平台，但可能无法完美反映原代细胞的复杂生物学表型；最后，由于获取血肿周围临床标本的伦理和后勤限制，研究结果缺乏人ICH组织的直接验证。总体而言，本研究揭示了ICH后炎症网络中的一个新型调控节点，Ninj1能否确立为可行的临床靶点仍有待严格的转化研究。
