《Cancer Reports》：Single-Cell Characterization of SPP1-Expressing Macrophages and Their Predicted Interactions With T Cells in the Breast Cancer Bone Metastatic Microenvironment
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背景：乳腺癌是女性中极为常见的恶性肿瘤，骨是其远处转移最常见的部位，显著增加死亡风险。
方法：本研究整合了单细胞RNA测序数据集（GSE266330和GSE243526），系统表征了乳腺癌正常组织、原发肿瘤和骨转移中的肿瘤微环境。
结果：研究共分析了来自整合队
背景：乳腺癌是女性中极为常见的恶性肿瘤，骨是其远处转移最常见的部位，显著增加死亡风险。
方法：本研究整合了单细胞RNA测序数据集（GSE266330和GSE243526），系统表征了乳腺癌正常组织、原发肿瘤和骨转移中的肿瘤微环境。
结果：研究共分析了来自整合队列的141 056个高质量单细胞，该队列包含一个骨转移数据集（GSE266330）和一个原发/正常乳腺数据集（GSE243526），鉴定出11种主要细胞类型。在骨转移队列中，研究人员鉴定出一个高表达SPP1的巨噬细胞亚群（Mac-SPP1），该亚群表现出M2极化特征、升高的代谢基因集富集，并表达HOXA9和MAF等转录因子（TF）。研究人员还鉴定了CD4-S100A9和CD8-GZMK T细胞亚群，它们具有高细胞毒性、高耗竭和代谢重编程特征。拟时序分析将CD4-S100A9细胞定位于推断的CD4?T细胞轨迹的一端，将CD8-GZMK细胞定位于推断的CD8?T细胞轨迹的中间节点。细胞间通讯分析预测Mac-SPP1通过SPP1-整合素（如SPP1-CD44）和CD74-MIF/COPA信号轴与这些T细胞亚群相互作用。
结论：本研究提供了乳腺癌骨转移微环境的单细胞表征，鉴定出一个表达SPP1的巨噬细胞亚群（Mac-SPP1），并预测了其与CD4-S100A9和CD8-GZMK T细胞的相互作用。由于骨转移标本与原发/正常标本来源于不同数据集，这些发现属于描述性结果，不能单独归因于转移进展，需要在同一研究中同时分析原发和转移标本的队列中进行实验验证和确认。
论文解读
一、研究背景与意义
乳腺癌是全球女性中发病率最高的恶性肿瘤，也是癌症相关死亡的第五大常见原因。骨是乳腺癌最常发生远处转移的部位，骨转移的发生显著增加了患者的死亡风险，因此迫切需要针对乳腺癌骨转移开展深入研究。肿瘤微环境（TME），尤其是其中特定的细胞亚群，在乳腺癌骨转移中发挥着关键作用。既往研究已揭示多种促进骨转移的分子机制，例如肿瘤来源的粒细胞集落刺激因子调节骨髓血管微环境、脯氨酸脱氢酶2影响羟脯氨酸代谢并促进SLC7A11和CXCL8表达、5-甲基胞嘧啶甲基转移酶NSUN2加速赖氨酸脱甲基酶6B mRNA降解从而激活Notch信号通路并增加RANKL表达、N6-甲基腺苷阅读蛋白YTHDF3增强ZEB1和SMAD5的翻译等。这些机制共同促进了乳腺癌骨转移，充分说明了其驱动机制的高度复杂性。
单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术的进步使研究人员能够精确而深入地研究肿瘤微环境和细胞异质性，从而揭示乳腺癌骨转移的潜在机制。已有研究在乳腺癌骨转移小鼠模型中鉴定出衰老骨细胞的转录组改变；另有研究表明SCUBE2在早期骨转移龛的成骨细胞亚群中富集，提示其可能在驱动"种子与土壤"相互作用中发挥作用。Wang等人进一步证明淋巴毒素-β（LTβ）在骨微环境中的肿瘤细胞中高表达，促进肿瘤的定植和生长。近期研究绘制了原发乳腺肿瘤及邻近正常组织的单细胞图谱，另一项大规模图谱研究则对八种实体瘤类型的42例骨转移进行了分析，提供了跨癌种共享及肿瘤特异性骨转移程序的首次比较，其中乳腺癌样本是主要组成部分。
然而，目前针对乳腺癌骨转移微环境中巨噬细胞与T细胞亚群之间相互作用的研究仍然有限。本研究整合了两个公共单细胞RNA测序数据集，系统表征了乳腺癌骨转移微环境的细胞异质性，鉴定转移龛中存在的巨噬细胞和T细胞亚群，并推断候选分子程序和细胞间相互作用，为后续研究提供了重要基础。
二、主要技术方法
研究人员整合了来自基因表达综合数据库（GEO）的两个公共scRNA-seq数据集：GSE266330（骨转移样本）和GSE243526（原发肿瘤及正常乳腺组织），共分析141 056个高质量单细胞。数据分析使用Seurat包（版本5.0.3）在R软件（版本4.2.2）中进行，包括批次整合、Harmony批次效应校正、基于规范标记基因的细胞类型注释。拟时序轨迹推断采用Monocle 2（DDRTree算法）；M1/M2极化评分、细胞毒性/耗竭评分及代谢基因集富集分析均采用singscore算法；转录因子（TF）活性分析采用pySCENIC（v0.12.1）；细胞间通讯分析采用CellPhoneDB v5.0；通路富集分析使用clusterProfiler（v4.6.2）结合KEGG数据库；生存分析使用TCGA-BRCA队列（PanCancer Atlas 2018，n=1082）的批量RNA-seq数据，采用Cox比例风险模型和Kaplan-Meier分析。
三、研究结果
3.1 乳腺癌骨转移肿瘤微环境的单细胞转录组表征
研究人员通过scRNA-seq系统表征了正常乳腺组织（Normal）、原发乳腺癌组织（Primary）和骨转移龛（Metastatic）三个组织 compartments 的免疫微环境。经严格质控和双细胞去除后，共保留141 056个细胞。整合和聚类分析鉴定出11种细胞群体，包括T细胞、成纤维细胞、上皮细胞、髓系细胞、血管周围样细胞、内皮细胞、肥大细胞、B细胞、HSPA6、周期细胞和浆细胞。与Normal和Primary组相比，Metastatic组表现出显著变化：髓系细胞和T细胞比例显著升高。髓系细胞中位比例从Normal组的0.58%升至Metastatic组的29.6%，T细胞中位比例从Normal组的2.1%升至Metastatic组的17.6%。这些发现表明髓系和T细胞区室在骨转移队列中丰富存在。
3.2 乳腺癌骨转移微环境中髓系细胞的特征与功能状态
研究人员基于标记基因聚类并注释了9个髓系细胞亚群：Mono-S100A8、Mac-SPP1、Mac-CXCL3、Mac-APOE、Mono-FCGR3A、Mono-GPX1、cDC、DC-LAMP3和Cycling Myeloid。值得注意的是，Mac-SPP1亚群几乎完全由骨转移数据集细胞组成（2132/2135个细胞，99.9%），而Mac-CXCL3和Mac-APOE主要来源于原发/正常数据集。Monocle 2轨迹分析将Mac-SPP1定位于推断轨迹的末端，具有最高拟时序评分。Mac-SPP1亚群表现出M2极化特征，且转移组整体巨噬细胞也显著偏向M2状态。相对于其他巨噬细胞亚群，Mac-SPP1细胞高表达TGFB1、VEGFA、SPP1、MSR1和TREM2。KEGG富集分析显示Primary和Metastatic组巨噬细胞差异表达基因（DEGs）主要富集于破骨细胞分化等通路。
3.3 Mac-SPP1巨噬细胞的转录与代谢特征
在TCGA-BRCA队列（n=1082，151例死亡）中，Mac-SPP1评分作为连续预测因子与总生存期（OS）无显著关联（HR 0.94，95% CI：0.82–1.09，p=0.43），经年龄、病理分期和PAM50亚型调整后仍不显著（调整后HR 0.99，p=0.85）。中位数分割的Kaplan-Meier分析同样无显著差异（log-rank p=0.99）。TF活性分析显示Mac-SPP1中高活性TF包括HOXA9、MAF、FOS和JUND。代谢基因集富集分析显示Mac-SPP1亚型在巨噬细胞亚型中代谢富集评分最高，Metastatic组也表现出高于Normal和Primary组的代谢富集。
3.4 乳腺癌骨转移中CD4?T细胞的景观、功能耗竭与转录调控
T细胞聚类鉴定出9个亚群：CD8-IL7R、CD4-LEF1、CD8-GZMK、T-CTLA4-CXCL13-n、CD8-GNLY、T-CTLA4-CXCL13-P、CD4-IKZF2、CD4-S100A9和CD8-AFF3。与Primary组相比，Metastatic组中CD4-IKZF2、CD4-LEF1、CD4-S100A9、CD8-AFF3、CD8-GNLY和CD8-GZMK比例显著增加。CD4-S100A9亚群基于CD2、CD3D和CD3E的稳健共表达被注释为T细胞，表现出激活且耗竭的转录谱（高细胞毒性和耗竭评分）。TF活性分析显示CD4-S100A9高表达YY1、CEBPD、SPI1、NFE2、JDP2、FLI1、FOSB等TF。KEGG分析显示CD4?T细胞DEGs与T细胞受体信号通路等密切相关。CD4-S100A9亚型表现出最高的代谢基因集富集。拟时序分析将CD4-S100A9定位于推断轨迹的一端，CD4-LEF1位于另一端，CD4-IKZF2位于中间阶段。
3.5 CD8?T细胞在肿瘤微环境中的功能动态与发育轨迹
CD8-AFF3、CD8-GNLY和CD8-GZMK具有高细胞毒性和耗竭评分。拟时序轨迹分析显示，具有中央记忆样表型的CD8-IL7R细胞位于轨迹根部，细胞沿推断轨迹向具有逐渐增强效应和耗竭程序的亚群进展。CD8-GZMK占据中间位置，保留效应程序（GZMK）同时开始获得耗竭相关特征。轨迹最终分为两个不同的终末状态：细胞毒性终末群体（CD8-GNLY）和耗竭群体（CD8-AFF3）。
3.6 Mac-SPP1与CD4-S100A9和CD8-GZMK T细胞的预测性通讯
TF活性分析显示CD8-GZMK细胞中ETV1高表达。KEGG富集分析显示Metastatic与Primary组间DEGs主要与核糖体、T细胞受体信号通路及PD-L1表达和PD-1检查点通路相关。三个效应CD8?亚群均表现出升高的代谢基因集富集。细胞间通讯分析预测Mac-SPP1巨噬细胞亚群与CD4-S100A9/CD8-GZMK T细胞之间的相互作用主要由SPP1相关通路（如SPP1-a4b1和SPP1-CD44）以及CD74-MIF和CD74-COPA等免疫调节分子对介导。
四、讨论与结论
本研究提供了乳腺癌骨转移微环境的单细胞表征，鉴定出SPP1?巨噬细胞亚群（Mac-SPP1）并预测其与CD4-S100A9和CD8-GZMK T细胞的相互作用。Mac-SPP1亚群在转移组中富集，表现出M2极化和升高的代谢基因集富集，与既往在其他癌症中对SPP1?肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）的报道一致。既往研究已证明SPP1?巨噬细胞可调节食管鳞状细胞癌对新辅助化疗和免疫治疗的耐药性，通过TNF-α和IL-1β分泌促进头颈部鳞状细胞癌的发展与进展，在结直肠癌中与FAP?成纤维细胞相互作用共同促进肿瘤生长，并通过与癌症相关成纤维细胞的相互作用促进结直肠癌肝转移。然而，本研究中的Mac-SPP1特征在TCGA-BRCA中与总生存期无显著关联，其预后价值尚未确立。HOXA9和MAF等高活性TF提示与免疫抑制、促肿瘤表型相关的调控网络。
T细胞是重要的免疫细胞群体，在包括乳腺癌和肝癌在内的多种癌症中改善临床结局中发挥关键作用。本研究鉴定出几乎仅存在于骨转移数据集中的CD4-S100A9?亚群，该亚群表现出独特的转录谱，提示为转移龛中应激响应的早期CD4?T细胞状态。CD8-GZMK?T细胞表现出耗竭特征和高代谢基因集富集，与进行性肿瘤中常见的功能失调但代谢活跃的转录状态一致。
巨噬细胞与T细胞之间的相互作用可驱动肿瘤进展。既往研究已证明SPP1?巨噬细胞与肝癌中肿瘤反应性CD8?T细胞之间的相互作用，以及转移性胃癌中SPP1?TAMs与CD8?耗竭T细胞的相互作用。然而，巨噬细胞和T细胞在乳腺癌骨转移中的作用此前未见报道。本研究通过细胞间通讯分析预测了Mac-SPP1?巨噬细胞与T细胞亚群之间的相互作用，主要由SPP1-整合素和CD74相关信号通路介导，提示巨噬细胞可能向T细胞功能障碍发出信号的潜在机制，但仍属计算预测，需实验验证。
本研究存在若干局限性：分析完全依赖公共单细胞数据集，骨转移样本数量有限；原发肿瘤和骨转移来自不同数据集，生物学条件与来源数据集完全混杂；比较涉及不同组织环境（骨与乳腺），且缺乏空间信息；多项患者特征报告不完整；作为观察性转录组数据的纯计算再分析，提供的是关联性而非因果性证据。确认Mac-SPP1和CD4-S100A9/CD8-GZMK亚群的功能角色需要实验验证，更大规模、匹配的队列结合空间分析将有助于证实和扩展这些发现。此外，由于整合数据集中未将破骨细胞和成骨细胞区分为独立聚类，细胞间通讯分析仅限于骨转移队列中观察到的免疫亚群。
研究结论：本研究通过单细胞转录组分析揭示了乳腺癌骨转移中特定巨噬细胞与T细胞亚群之间的协调相互作用，这种相互作用与骨转移龛中免疫抑制、代谢适应的微环境相关。Mac-SPP1-CD4-S100A9/CD8-GZMK相互作用是否代表破坏骨转移的可治疗靶点轴仍需实验验证。
