阳离子聚合物絮凝在单克隆抗体（mAb）初级回收阶段降低高风险宿主细胞蛋白（HCPs）并去除宿主细胞DNA

《Biotechnology Progress》：Flocculation using selected cationic polymers reduces high-risk host cell proteins in monoclonal antibody processes already during primary recovery

　　

高度强化的单克隆抗体（mAb）生产需要下一代纯化技术以实现工艺精简。阳离子絮凝剂（cationic flocculants）有助于澄清，并可降低DNA和宿主细胞蛋白（HCPs），从而减轻纯化负担。使用两种不同mAb，研究人员筛选了五种不同阳离子絮凝剂，评估其在澄清细胞培养液的同时去除宿主细胞DNA和HCPs而不影响抗体产量和完整性的潜力。研究人员鉴定Polymer X为最佳性能者，与未处理参照相比，其HCP降低达到30%–50%。与市售聚合物（Polymer D）比较，Polymer X对四种不同mAb显示出显著更高且更稳健的HCP降低。此外，研究人员研究了高风险HCPs的降低，这些HCPs已知会对最终产品质量或患者安全产生负面影响。研究人员证明，与Polymer D絮凝相比，Polymer X在降低这些HCPs方面表现优异。Polymer X可成功用于（1）辅助细胞培养澄清，实现低于25 NTU（Nephelometric Turbidity Units，散射浊度单位）的浊度；（2）维持高mAb滴度，在四种mAb中的三种实现超过95%的产量；（3）将宿主细胞DNA降低99%以上；（4）将总HCPs降低至多40%，包括将选定的高风险HCPs去除90%以上。在典型mAb纯化方案中，使用阴离子交换色谱（anion exchange chromatography，AEX）去除DNA和残留HCPs。Polymer X所显示的稳健HCP和DNA去除可能支持纯化工艺精简。

该研究围绕高强化单克隆抗体（mAb）生产中的初级回收与杂质控制问题展开。mAb在新批准生物药中占比超过50%，并在2020年至2022年占蛋白类生物药全球销售的80%；CHO细胞培养过程持续优化以提高mAb滴度，Mahé et al.曾报道补料分批培养中mAb模型滴度超过11 g/L。高滴度依赖高细胞密度培养，可达50×10⁶ cells/mL，但细胞数量增加会降低产物与培养基的分离效率，可能导致多步深度过滤并增加工艺时间与复杂性；碟片离心机虽可处理更高细胞密度和通量，但多数情况下仍需二级过滤澄清。宿主细胞DNA和宿主细胞蛋白（HCPs）等可溶性杂质增加会加重下游负担，DNA升高可导致深度过滤堵塞。Jones et al.在多公司合作中鉴定28种“高风险”HCPs，并按其对产品质量、制剂、人体生物学功能或免疫原性的影响分为四类；这些HCPs，尤其高风险HCPs，在传统mAb纯化中难以去除，部分HCPs被认为与染色质复合物或mAb产品形成簇集而逃避Protein A亲和色谱，需额外洗涤或先进精制步骤。阳离子聚合物絮凝可在细胞收获阶段结合带负电的细胞、细胞碎片、宿主细胞DNA及某些HCPs，形成大絮体，机制涉及带电聚合物吸附导致表面电荷降低以及颗粒间桥接；常用阳离子聚合物包括聚乙烯亚胺（PEI）、壳聚糖和聚二烯丙基二甲基氯化铵（pDADMAC）。但残留聚合物检测困难，pDADMAC定量方法较复杂且需先进设备；部分甲基丙烯酸酯类阳离子聚合物可导致细胞毒性。已有研究表明絮凝可提高深度过滤容量和离心通量，pDADMAC可使过滤容量提高至约400–500 L/m²，但重力沉降时间超过30 min可能不适合工业；DNA清除常超过95%，而HCP降低多在0%–50%，最优条件下最高约70%，高风险HCPs的絮凝去除尚未被详细描述。因此，研究人员比较六种具有不同“背景化学”的阳离子聚合物，以澄清、保持高抗体产量、降低宿主细胞DNA和降低HCPs四项主要性能标准评价最佳聚合物浓度，并特别关注最佳聚合物及市售Polymer D对高风险HCPs的特异性去除。研究结论表明，Polymer X在HCP降低方面表现最佳，对四种mAb均显著优于Polymer D，并可实现低于25 NTU的澄清、三种mAb中超过95%的产量、超过99%的DNA降低以及至多40%的总HCP降低，同时将选定高风险HCPs去除90%以上；该策略在初级回收阶段降低高风险HCP负担，可能支持mAb纯化工艺精简，并对改善药物产品质量具有潜力，但仍需完整工艺表征和质量属性检测验证。

关键技术方法概括（不超过250字）：关键技术包括摇瓶与生物反应器补料分批培养获取细胞培养液；在pH 6条件下以六种阳离子聚合物絮凝，低离心力沉降后取上清；以浊度法评价澄清，Protein A亲和色谱测定mAb浓度，PicoGreen法测定双链DNA（dsDNA），CHO HCP ELISA（经阳离子交换树脂预处理去除残余聚合物）测定总HCP，液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）对mAb 1与mAb 2进行HCP及高风险HCP半定量，二维高效液相色谱-带电气溶胶检测（2D-HPLC-CAD）定量残留聚合物。样本队列来源为mAb 1 Trastuzumab（CHO-S，内部细胞系）、mAb 2 Anti-Spike（CHO-GS，Icosagen AS，仅研究用途）、mAb 3 Adalimumab（CHO-K1，内部细胞系）和mAb 4 cNISTmAb（CHO-K1，NIST Research Grade Test Material 10197）。

研究结果如下。3.1 针对两种不同mAb产品的新型聚合物筛选：研究人员以澄清效率、mAb回收、DNA降低和HCP降低评价Polymer A、C、P、L、X、D，发现絮凝效率同时取决于聚合物和产生抗体的细胞系，Polymer X在多项指标中表现最佳。3.1.1 澄清效率：通过低离心力沉降后测定上清浊度，所有絮凝剂在高于预先确定的最低浓度时均改善澄清，存在最优浓度区间；未絮凝参照中mAb 1批次浊度约300 NTU，mAb 2批次约100 NTU。3.1.2 单克隆抗体回收：以超过95%产量为目标，几乎所有絮凝剂在其最优浓度范围内均达到该目标，仅Polymer A与mAb 1为89%；高浓度某些絮凝剂导致表观回收超过100%，与Protein A分析中的UV280信号升高和峰拖尾有关，Polymer C和L与色谱材料相互作用更强，Polymer L还与MabSelect PrismA发生相互作用，因此C和L被排除。3.1.3 宿主细胞dsDNA降低：以超过99%DNA去除为目标，多数絮凝剂在广泛浓度范围内达到99%以上；Polymer C和Polymer X在最宽浓度范围内满足目标，Polymer P在高浓度下最低DNA降低仍超过95%。3.1.4 宿主细胞蛋白降低：HCPs异质性强，阳离子聚合物主要结合带负电物种，疏水相互作用可作为二次增强力；为排除残余聚合物对ELISA干扰，样品经阳离子交换树脂预处理；Polymer C（1000 ppm）、Polymer L（1000–1750 ppm）和Polymer X（600–1400 ppm）对两种细胞系均显示良好总HCP降低，Polymer X优于其他絮凝剂且有效范围最宽。3.1.5 最优聚合物浓度：由于各絮凝剂最优浓度不同且不同关键参数的最优浓度可能不同，研究人员以HCP降低为最重要标准确定最优浓度；Polymer X在澄清、mAb产量、DNA降低和HCP降低方面总体最佳，HCP降低最好且最可重复；Polymer C表现相似但与Protein A分析相互作用导致错误结果，后续聚焦Polymer X与Polymer D。3.2 Polymer X与Polymer D的深入比较：研究人员在Polymer X 1000 ppm和Polymer D 750 ppm下用四种mAb比较两种絮凝剂。3.2.1 絮凝过程：通过四種mAb的絮凝与上清分析，两者均使残余浊度低于25 NTU；Polymer X形成较大絮体（显微镜粗略估计可达1 mm）且仅靠重力即可快速沉降；两者DNA降低至少98%，Polymer X超过99%；两者对几乎所有mAb实现≥95%产量，Polymer D在mAb 3和mAb 4中产量显著更高，但可能与Protein A分析方法轻微干扰有关；Polymer X对四种mAb的总HCP降低约30%，显著高于Polymer D约10%，且Polymer X在多达11个生物重复中变异更小。3.2.2 蛋白质组水平HCP降低：通过LC-MS对mAb 1和mAb 2絮凝后样品进行半定量，mAb 1鉴定1774±48种HCPs，mAb 2鉴定1628±25种；Polymer X较Polymer D降低更多HCPs，相对MS强度降低超过99%的HCPs约100种/细胞系，而Polymer D约一半；以50%降低为阈值时，Polymer X使超过400种HCPs达到该阈值，Polymer D约少三分之一；两种mAb中均被降低99%以上的HCPs，Polymer X为30种，Polymer D为6种，且两聚合物在同一mAb中重叠很少，提示聚合物特异性。3.2.3 高风险HCP：通过LC-MS检测Jones et al.分类的高风险HCPs，Polymer X使cathepsin B在mAb 2中降低超过90%、在mAb 1中降低超过50%，Polymer D分别仅6%和27%；MMP-19被两者有效降低，Polymer X处理后在所用分析条件下无可检测MS信号；HTRA1在两者处理后均低于初始30%，Polymer X略高；CLU在Polymer D处理下降低约70%，Polymer X约98%；GRP78在Polymer D处理下mAb 1和mAb 2残余分别为80%和70%，Polymer X处理下仅5%和3%；Polymer X使mAb 1中9种、mAb 2中8种高风险HCPs降低超过50%，Polymer D仅使mAb 1中4种、mAb 2中5种降低超过50%。3.3 生物反应器培养中残留聚合物测定：讨论指出整合额外单元操作需收益超过复杂度；Polymer X形成的大絮体可快速沉降并可能被大网孔陶瓷或金属滤材截留，初步试验显示高潜力但详细研究超出本文范围；摇瓶结果向工业规模转移需进一步测试，生物反应器搅拌剪切及碟片离心剪切可能影响絮体大小、稳定性和过滤性能；用补料分批发酵细胞进行初步絮凝，调整Polymer X浓度以匹配更高细胞浓度后，絮凝效率和杂质去除与摇瓶培养相似（数据未显示）；阳离子聚合物毒性要求证明其不存在或低于可接受残留限，可依据聚合物特异性每日允许暴露量（PDE）或按ICH Q6B和ICH Q9以科学和风险为基础确定；残留聚合物定量具挑战性，研究人员开发样品前处理以分离聚合物和抗体，絮凝后Polymer X和Polymer D残留均低于检测限（Polymer D为10 ppm，Polymer X为20 ppm），后续Protein A色谱、过滤和阳离子交换色谱预期进一步清除残留聚合物。

讨论部分总结：该研究将絮凝定位为初级回收阶段的强化手段，Polymer X的大絮体快速沉降特性可能利于离心、深度过滤及连续mAb纯化，但工业放大仍需验证剪切对絮体稳定性和过滤性能的影响；残留阳离子聚合物需按PDE或ICH Q6B、ICH Q9控制并证明患者安全，所建立的2D-HPLC-CAD方法及样品前处理可在高蛋白基质中定量残留聚合物，且絮凝后残留低于检测限，下游多步纯化预期进一步清除。研究结论翻译如下：在本研究中，研究人员成功鉴定了一种阳离子聚合物，可通过改善细胞培养澄清、有效降低宿主细胞DNA和HCP含量，同时保持高抗体产量，从而增强抗体纯化。向细胞培养物中加入Polymer X使浊度最多降低16倍，读数低于25 NTU，同时维持高抗体滴度（>95%）。在四种不同mAb中，DNA降低99%以上，HCPs降低约40%，证明工艺稳健性。与常用阳离子Polymer D比较显示，Polymer X提高工艺性能，尤其在HCP降低方面。质谱分析显示，Polymer X絮凝后约1700种HCPs中约100种的相对MS信号强度降低99%或更多；使用Polymer D仅约50–60种HCPs可降至该水平。研究人员还证明，加入Polymer X辅助澄清可成功去除某些高风险HCPs，将其降至极低残留水平，有时不可检测。这些高风险HCPs已知在药物产品中存在时会引起不良效应。通过在细胞去除阶段大幅降低高风险蛋白，Polymer X絮凝可能减轻下游纯化负担，并具有改善药物产品质量的潜力，但这需要通过完整工艺表征和纯化材料质量属性检测验证。计划未来研究对补料分批发酵培养的整个纯化工艺进行详尽分析，并与是否引入聚合物诱导絮凝进行比较；该研究还将调查澄清效率和过滤性能，以及絮凝对后续色谱步骤抗体产量和纯度的影响。