日粮槲皮素对老龄蛋鸡产蛋性能、卵巢免疫及血清色氨酸/吲哚相关代谢特征的多组学响应

《Poultry Science》：Integrated multi-omics analysis reveals coordinated microbial, metabolic, and ovarian immune responses to dietary quercetin in aged laying chickens

　　

卵巢衰老与产蛋性能下降相关，但老龄蛋鸡对日粮槲皮素的短期生理与分子响应仍未完全阐明。在一项为期30 d的饲养试验中，180只Hy-Line White母鸡（480日龄）接受补充0、200或600 mg/kg槲皮素的日粮（每处理6笼；每笼10只）。按笼记录产蛋量，并于第30天评估卵巢、生化和分子终点。比较对照组与600 mg/kg组（每组n = 6只）的盲肠微生物群、血清代谢组学和卵巢转录组学。与对照组相比，接受600 mg/kg槲皮素的母鸡四周平均产蛋率更高（90.67% vs. 87.74%），小白色卵泡（small white follicles, SWFs）更多，肝脏和卵巢抗氧化酶活性增加。微生物组组成分析（analysis of compositions of microbiomes, ANCOM）仅支持一个属水平分类单元（DEV114）存在差异。非靶向代谢组学基于名义显著性标准筛选出552个探索性特征，包括被推定注释为色氨酸和吲哚相关代谢物的信号升高。卵巢分析显示CYP1B1（cytochrome P450 family 1 subfamily B member 1，细胞色素P450家族1亚家族B成员1）表达增加、NLRP3（NLR family pyrin domain containing 3，NOD样受体家族含pyrin结构域蛋白3）蛋白丰度降低、免疫和凋亡相关转录本改变，以及SWFs中TUNEL（terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling，末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记）阳性降低。在假发现率（false discovery rate, FDR）校正后，跨组学关联未保持显著，限制了对独立微生物群–代谢物–卵巢关系的推断。总之，这些发现对老龄蛋鸡对日粮槲皮素的短期生殖和分子响应进行了整合表征，并突出了用于针对性机制研究的候选代谢和免疫特征。

研究背景与目的：鸡蛋为营养密集食品，商业蛋鸡约60周龄后产蛋性能下降，伴随卵泡层级紊乱和小白色卵泡（small white follicles, SWFs）储备耗竭；SWFs是可供层级发育的主要可募集储备，维持该储备对卵巢韧性和后期产蛋可持续性重要。卵巢衰老不仅由抗氧化能力下降引起，还涉及卵泡耗竭和闭锁、类固醇生成和卵泡选择受损，以及氧化、代谢、内分泌、细胞外基质和免疫调节紊乱。多种日粮生物活性物可经抗氧化、代谢、内分泌、抗炎或抗铁死亡活性改善卵巢或产蛋性状，但多数研究侧重生理生化终点，连接日粮生物活性物与老龄卵巢分子变化的化学和代谢中间物尚不明确。槲皮素（quercetin）是膳食黄酮醇，除直接抗氧化外还经肠道、肝脏和微生物广泛生物转化，其系统效应可能涉及母体及结合型或微生物生成代谢物；在蛋鸡中与生产性能、蛋品质、抗氧化状态、循环脂质和激素、免疫指标及盲肠菌群相关，并可经菌群调节缓解肠道炎症和改善屏障功能。然而这些结果多被分别研究，槲皮素响应性微生物变化是否与循环代谢特征及协调的卵巢分子响应同时出现尚不清楚。肠道菌群是黄酮醇生物转化和芳香氨基酸代谢调节的重要部位；色氨酸可经宿主犬尿氨酸和血清素通路或经微生物转化为色胺、吲哚类和相关衍生物，参与屏障完整性、线粒体代谢、炎症和免疫信号调节；菌群也通过免疫、内分泌、氧化和代谢机制参与卵巢衰老。因此，研究人员整合生产性状、卵泡形态、组织抗氧化指标与盲肠16S rRNA基因测序、非靶向血清代谢组学、基于MetOrigin的来源归因和卵巢RNA测序（RNA-seq），考察槲皮素相关卵巢表型是否与特定血清代谢和卵巢转录响应同时出现，并探索盲肠分类群、推定注释的色氨酸/吲哚相关血清特征与卵巢免疫相关基因的关联；该30 d研究表征短期响应，而非检验槲皮素是否延缓卵巢衰老或延长产蛋持续期。

关键技术方法（不超过250字）：研究使用180只480日龄Hy-Line White母鸡（购自Huajie Poultry Co., Ltd.，杭州，浙江），随机分为基础日粮及补充200或600 mg/kg槲皮素日粮，每组6笼、每笼10只，饲养30 d；按笼记录产蛋，第30天每组取6只采样。比较对照组与600 mg/kg组的盲肠16S rRNA基因V4区扩增子测序（QIIME 2/DADA2、SILVA、LEfSe、ANCOM）、血清非靶向LC–MS/MS代谢组学（PCA、PLS-DA、KEGG、MetOrigin）及卵巢RNA-seq（DESeq2、GO/KEGG/GSEA）；并用RT-qPCR、Western blot、免疫荧光、苏木精–伊红（hematoxylin and eosin, H&E）染色和TUNEL验证；统计采用重复测量混合模型、ANOVA/t检验及Spearman/Mantel关联与FDR校正。

主要研究结果：
（1）日粮槲皮素对老龄蛋鸡产蛋性状、蛋品质、卵巢特征及血清生化指标的影响。通过30 d饲养和重复测量混合模型，Q600组第1周和第4周产蛋率高于Con，四周平均产蛋率高于Con和Q200；Q600组SWFs数多于Con和Q200，其他卵泡和闭锁卵泡数无差异；蛋重、蛋壳厚度、蛋壳强度、末周蛋内部品质及血清TG、TChol、NEFA、HDL-C、LDL-C和E2无一致改变；卵巢和肝脏组织学未见明显处理相关异常。
（2）槲皮素增强老龄蛋鸡组织特异性抗氧化酶防御。通过血清、肝、卵巢抗氧化指标，两个剂量均降低血清MDA；肝T-SOD和GSH-Px升高，Q200的T-SOD反应最强；Q600卵巢T-SOD和GSH-Px升高；卵巢MDA和T-AOC不变。结论为槲皮素主要强化特定酶抗氧化系统，而非普遍提高总抗氧化能力。
（3）槲皮素选择性改变老龄蛋鸡盲肠微生物组成。Q600未改变α多样性；PCoA显示部分重叠；LEfSe提示Q600富集Bacilli、Muribaculaceae等，Con富集Akkermansia、DEV114、Zag_111；ANCOM仅属水平DEV114满足阈值，科/纲水平无。结论为选择性改变但统计支持有限。
（4）槲皮素相关血清代谢特征富集色氨酸和吲哚相关注释。PLS-DA显示组间分离（R²Y=0.993，Q²Y=0.806），PCA示处理相关变异；按VIP>1.0、名义P<0.05和FC>1.2或<0.833筛选552个特征（383升高、169降低）；KEGG富集色氨酸代谢、ABC转运、苯丙氨酸/酪氨酸/色氨酸生物合成、神经活性配体–受体互作和生物素代谢；1H-indole-3-acetamide、5-methoxy-L-tryptophan、tryptamine和5-hydroxyindole信号升高。结论为Q600相关血清特征富集色氨酸/吲哚注释，属探索性。
（5）槲皮素改变卵巢免疫相关转录和CYP1B1表达。RNA-seq识别278个DEG（188上调、90下调）；PPI示CCL5、CCR8、CX3CR1、IL18、ICOS、GNLY、GZMA、CD3D、CATH3免疫相关网络；GO/KEGG富集免疫调节、细胞因子–受体互作、激素相关信号、溶酶体和先天免疫；GSEA示Toll样受体信号正富集，溶酶体、肠道IgA免疫网络和细胞因子–细胞因子受体互作负富集。靶向验证示CYP1B1免疫荧光增加，NLRP3荧光和蛋白降低；Q600的CYP1B1和BCL2 mRNA升高，NLRP3、IL18、BAX和CCL5降低，AHR1A和CASP1不变；SWFs中TUNEL阳性低于Con和Q200。结论为选择性卵巢免疫转录重塑、CYP1B1增加、NLRP3相关响应降低和SWFs凋亡相关DNA片段减少，但未建立AhR激活或炎性体活性改变。
（6）基于MetOrigin的分析提示血清代谢特征的潜在来源。MetOrigin计算注释示食物相关最多，未知、药物和微生物相关次之，宿主和环境相关较少；28个特征推定为宿主–微生物共享，36个仅微生物相关，1个仅宿主相关；预测微生物相关和共享通路多于宿主特有通路，未识别宿主特异通路；色氨酸代谢最富集，其次甘油磷脂代谢、吲哚生物碱生物合成、苯丙氨酸/酪氨酸/色氨酸生物合成和嘌呤代谢。结论为提示潜在来源，但属计算预测，不证明生物来源。
（7）探索性多组学关联和敏感性分析。Spearman和Mantel探索示合并样本中Akkermansia、Butyricimonas、Anaerofustis和Clostridium等与卵巢免疫相关DEG相关；methyl gallate、5-methoxy-L-tryptophan、5-hydroxyindole和1H-indole-3-acetamide与部分菌属及卵巢免疫相关基因相关；69个Mantel比较中10个名义显著，FDR校正后无显著（最小q=0.069）；处理调整后184个属–代谢物和345个代谢物–卵巢比较中34个名义显著，方向在留一母鸡分析中保留，但校正后无显著；涉及四个优先色氨酸/吲哚特征的92个处理调整关联均未达名义显著。结论为跨组学关联仅探索性，不能建立处理独立关系。

讨论与结论：最明显的卵巢表型为Q600组SWFs数增加；SWFs作为可募集的前层级卵泡池，对后期卵泡发育重要。Q600提高四周平均产蛋率，但周间响应不一致，蛋重、蛋内部品质、循环雌二醇和脂质指标无一致改变，故不能推断长期产蛋持续期延长。BAX降低和BCL2升高伴SWFs中TUNEL阳性降低，提示该卵泡群凋亡相关变化减弱，但闭锁卵泡和后期卵泡类别无显著差异且仅第30天评估，不能区分卵泡损失减少与募集/进展改变。第1周产蛋率差异早于第30天卵泡评估，不能由SWF计数解释；无处理前产蛋率，不能排除组间差异；未记录采食量。抗氧化作用呈组织依赖，未普遍提高T-AOC。菌群LEfSe与ANCOM结果不一致，样本量有限，测序丰度不能反映绝对菌群变化或代谢活性。代谢组特征选择基于名义P值而未FDR校正，代谢物身份未经标准品确认，MetOrigin来源归因为计算预测。卵巢RNA-seq示通路特异性免疫重塑，NLRP3、IL18和CCL5降低但CASP1不变，不能建立炎性体激活降低；bulk组织异质且免疫荧光无细胞类型标志，细胞来源不明。跨组学关联经FDR校正后均不显著，合并相关可能部分反映对槲皮素的共同响应而非处理独立生物互作。局限包括30 d短期、未记录采食量、仅比较Con与Q600、样本量小及未直接评估AhR激活、炎性体活性和卵泡闭锁动态；未来需标准品确认、微生物功能分析、独立队列验证和细胞分辨卵巢实验。

研究结论部分翻译：在存在上述局限性的前提下，日粮槲皮素与老龄蛋鸡SWFs计数增加、组织特异性抗氧化响应、有限的微生物变化、推定注释的色氨酸和吲哚相关血清特征信号升高以及卵巢分子指标改变相关。卵巢验证显示CYP1B1表达增加、NLRP3相关分子响应降低以及SWFs中TUNEL阳性降低，并伴凋亡相关转录本改变。这些发现未建立芳香烃受体（aryl hydrocarbon receptor, AhR）激活、炎性体活性改变或SWF计数增加的机制。研究结果支持各测量系统存在平行的处理相关响应，但不支持因果性的微生物群–代谢物–卵巢通路。因此，所提出的模型仍是未来机制检验的假设。