《Poultry Science》：Single-Cell RNA Sequencing Identifies
JUN as a Candidate Regulator Associated with Follicular Development in Hainan Wenchang Hens
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对优势卵泡（AVF）进行单细胞转录组测序，揭示了高产与低产海南文昌鸡（HYLH、LYLH）之间存在显著转录差异。卵泡发育正常（FDN）母鸡表现出较高产蛋率，而卵泡发育停滞（FDA）个体产蛋性能显著降低。排卵前卵泡停滞主要与AVF选择相关。因此，采用单细胞RNA
对优势卵泡（AVF）进行单细胞转录组测序，揭示了高产与低产海南文昌鸡（HYLH、LYLH）之间存在显著转录差异。卵泡发育正常（FDN）母鸡表现出较高产蛋率，而卵泡发育停滞（FDA）个体产蛋性能显著降低。排卵前卵泡停滞主要与AVF选择相关。因此，采用单细胞RNA测序研究FDN与FDA组AVF的差异。研究人员鉴定出13个不同细胞簇，鉴于颗粒细胞（GCs）在卵泡发育中的关键作用，重点关注GCs。比较分析在FDN与FDA母鸡GCs中鉴定出167个差异表达基因（DEGs）。基于单细胞转录组数据的探索性分析，选择JUN进行后续功能研究。这提示JUN可能与卵泡发育和产蛋性能相关。构建JUN过表达质粒并转染至从卵泡分离的原代GCs。采用细胞计数试剂盒-8（CCK-8）法评估细胞活力，发现JUN过表达增强GC活力。与对照组相比，JUN过表达组GC培养上清中促性腺激素释放激素（GnRH）、促卵泡激素（FSH）和促黄体生成素（LH）浓度显著升高，睾酮（TESTO）浓度显著降低，采用酶联免疫吸附测定（ELISA）检测。为阐明潜在分子机制，对JUN过表达GCs进行转录组测序。差异表达分析鉴定出众多参与细胞增殖、免疫调节和代谢过程的基因。综上，本研究提示，通过单细胞转录组分析鉴定的JUN可能增强GCs活力，并与GC培养上清中激素浓度改变相关。这些发现为HYLH与LYLH产蛋性能差异的分子机制提供了新见解，并可能为提高家禽繁殖效率提供潜在靶点。
研究背景与问题：鸡肉为营养白肉，脂质、热量和胆固醇较低；家禽生产在全球农业中重要。海南文昌鸡为海南黄羽鸡，肉质优良但产蛋较低，限制养殖盈利，因此提高产蛋具有产业意义。卵泡发育决定产蛋能力，高产蛋鸡具有组织化卵泡等级；禽类卵泡分为原始卵泡、初级卵泡、选择前卵泡（1–8 mm）和排卵前卵泡（>9 mm）。约6–8 mm选择前卵泡被招募进入等级，经F5至F1后排卵；最佳排卵率依赖周期性卵泡选择，即从选择前卵泡池招募一个优势卵泡（AVF）。颗粒细胞（GCs）是卵泡主要体细胞，对卵泡发育、选择、结构完整及卵母细胞成熟重要；卵泡发育和选择依赖促卵泡激素（FSH）及其受体（FSHR）；GCs在選擇阶段响应FSH表达FSHR；GC凋亡是卵泡闭锁关键驱动。JUN（c-Jun）为激活蛋白-1（AP-1）转录因子核心组分，调控细胞增殖、分化、凋亡；小鼠JUN敲除导致性腺类固醇降低和生育受损；人颗粒/黄体细胞FOS/JUN AP-1复合物调控围排卵期胆固醇生物合成和代谢变化；c-JUN可作为STAT5B共激活因子调控Leydig细胞STAR转录和类固醇激素生成；c-Jun通过上调细胞周期调节因子和抑制肿瘤抑制因子正调控增殖。但JUN在禽类卵泡发育和产蛋性能中的作用尚未探索。文昌鸡卵泡发育及GC功能分子机制不清，缺乏系统研究；本研究比较高产与低产鸡，采用单细胞RNA测序（scRNA-seq）和转录组测序，识别JUN并进行体外功能验证。
关键方法（不超过250字）：样本队列来自海南（Tanniu）文昌鸡有限公司的海南文昌鸡，依据29–39周产蛋记录每组100只筛选HYLH与LYLH，并经卵巢形态分为卵泡发育正常（FDN）和卵泡发育停滞（FDA）。scRNA-seq取6只鸡（FDN 3只、FDA 3只），每只取一个AVF且不混合，采用10x Genomics Chromium 3′建库、Illumina NovaSeq 6000测序，经CellRanger、Seurat聚类注释，伪bulk DESeq2鉴定GCs差异表达基因（DEGs），并进行GO/KEGG和CellChat分析。构建pcDNA3.1-JUN转染原代GCs，采用CCK-8、ELISA、qPCR和RNA荧光原位杂交（RNA-FISH）验证；JUN过表达GCs行RNA-seq，每组3个生物学重复，经fastp、HISAT2、featureCounts和DESeq2分析。
研究结果：
（1）高产与低产海南文昌鸡产蛋性能比较与卵泡数量相关（Comparison in egg production between HYLH and LYLH is associated with the number of follicles）。通过29–39周产蛋记录和不同发育阶段卵泡计数比较发现，HYLH每周约5.5枚且稳定，LYLH约0.6枚；HYLH的AVF和排卵前卵泡（POVF）数显著高于LYLH，小白色卵泡（SWF）数显著较低，小黄色卵泡（SYF）数无显著差异；提示产蛋差异与卵泡数量相关。
（2）FDN与FDA母鸡表型和生理特征比较（Comparison of phenotypic and physiological characteristics between FDN and FDA hens）。通过卵巢形态、血清激素ELISA和GCs qPCR比较发现，LYLH多数缺乏排卵前卵泡，归为FDA；HYLH卵泡等级完整，归为FDN。FDN血清促性腺激素释放激素（GnRH）和促黄体生成素（LH）显著较高，生长激素释放激素（GHRH）、FSH、催乳素（PRL）、孕酮（PROG）无显著差异；FDN GCs中促黄体生成素受体（LHCGR）、FSHR、3β-羟基类固醇脱氢酶1型（HSD3B1）mRNA显著较高，类固醇生成急性调节蛋白（STAR）、细胞色素P450侧链裂解酶（CYP11A1）无显著差异；提示发育停滞伴随循环GnRH/LH较低及GCs促性腺激素受体和类固醇合成相关基因表达较低，但mRNA差异不直接证明激素合成或类固醇活性差异。
（3）FDN与FDA鸡AVF的scRNA-seq（scRNA-seq of AVF from FDN and FDA Hens）。通过scRNA-seq比较发现，质控后分别保留26,284和27,548个细胞，鉴定13个细胞簇，注释膜细胞（TCs）、T细胞、浆细胞、卵母细胞、神经嵴细胞、髓系细胞、壁细胞、间皮细胞、间充质干细胞（MSCs）、GCs、成纤维细胞、红细胞和内皮细胞（ECs）；GCs标记富集于FSH信号和雌激素代谢。GCs中鉴定167个DEGs（FDA相对FDN：45个下调、122个上调）；KEGG显示上调基因富集Notch、糖胺聚糖生物合成、间隙连接、细胞外基质（ECM）-受体相互作用，下调基因富集类固醇生物合成、脂肪细胞因子、PPAR、RIG-I样受体、细胞因子-细胞因子受体相互作用。CellChat显示GCs相互作用数FDN为100、FDA为85，FDN GCs中雌二醇、WNT、BMP、胶原信号预测较高，FDA层粘连蛋白信号较高；提示AVF细胞组成、GCs转录及细胞通讯存在差异。
（4）JUN表达与卵泡发育状态相关（JUN Expression Is Associated with Follicular Development Status）。通过单细胞转录因子分析、FISH及JUN过表达后qPCR/ELISA/CCK-8发现，JUN在FDN GCs中CellChat推断通讯评分最高（0.237）；FISH显示JUN信号主要定位于AVF的GC层，TCs信号弱或不可测。JUN过表达后GnRHR、LHCGR、孕激素受体（PGR）、STAR、CYP17A1 mRNA显著升高，FSHR、HSD3B1无显著差异；培养上清LH、GnRH、FSH显著升高，TESTO显著降低；12、18、24 h JUN组450 nm吸光度显著较高，6 h形态相当；提示JUN过表达增强GC活力，并伴随激素受体/类固醇合成基因表达及上清激素浓度变化。
（5）JUN过表达GCs的转录组分析（Transcriptomic Analysis of GCs Following JUN Overexpression）。通过JUN过表达GCs RNA-seq发现众多DEGs，下调包括TENT5B、CRB2、SFXN1，上调包括PTEN、POLA1、HSPA4、TRHR1；GO显示上调基因涉及免疫反应，下调基因涉及生物合成和信号调控（包括BMP、TNF信号）；细胞组分上调涉及免疫球蛋白和胶原复合物，下调涉及mRNA加工和RNA聚合酶复合物；分子功能上调涉及MHC受体活性和类固醇脱氢酶活性，下调涉及RNA聚合酶和肽酶活性；KEGG显示上调通路包括B细胞受体、破骨细胞分化、抗原加工提呈、自然杀伤（NK）细胞介导细胞毒，下调通路包括RNA聚合酶、ATP依赖染色质重塑、核苷酸切除修复、自噬；提示JUN过表达与免疫调节、生物合成及关键信号通路改变相关。
讨论部分总结：JUN为AP-1核心亚基，广泛参与增殖、分化、凋亡；生殖系统中参与促性腺激素受体表达和类固醇生成。小鼠GnRH受体表达细胞条件性敲除JUN可致生殖功能受损，包括LH分泌降低、发情周期延长和精子数减少。单细胞探索性分析提名JUN用于鸡GCs功能研究；JUN可能不仅作为经典AP-1转录因子，还可能以禽类物种特异方式参与生殖内分泌调控。JUN过表达促进GC活力，与其正调控细胞周期的作用一致；并增加GnRHR、LHCGR、PGR mRNA，提示JUN在GCs激素相关信号中的潜在作用，但其对受体蛋白丰度和细胞反应的影响尚待确定。免疫相关通路富集与AP-1免疫调节作用一致；c-Jun和JunB对树突状细胞身份和功能、抗原交叉提呈及TLR介导免疫反应重要，JUN/AP-1调控细胞因子表达和炎症反应；卵巢微环境中免疫细胞可通过细胞因子信号影响卵泡发育。JUN过表达还伴随GC培养上清激素浓度改变；下调基因富集于转录和染色质重塑通路，可能反映GCs细胞状态改变，但功能后果需进一步研究。限制包括：JUN与靶基因的分子互作尚未完全阐明，需ChIP-seq界定全基因组结合位点并验证候选靶基因；本研究仅聚焦JUN，其他AP-1亚基（JUNB、JUND、c-Fos、FRA1/2）也可能参与卵泡发育；激素仅测GC培养上清，未设无细胞培养基对照，不能排除培养基贡献，不能证明GCs新合成或分泌改变，也不能证明自分泌/旁分泌机制，检测激素来源及浓度变化过程需进一步研究。
研究结论翻译：探索性单细胞转录组分析提名JUN作为鸡GCs功能研究的候选调控因子。功能实验提示JUN过表达促进细胞活力。ELISA显示JUN过表达与GC培养上清中GnRH、FSH、LH浓度升高及TESTO浓度降低相关。转录组分析进一步将JUN过表达与免疫相关和代谢通路改变联系起来。这些发现为JUN在体外调节GC功能的潜在作用提供初步证据，并为家禽产蛋性能差异的未来研究提供分子见解。
