长期有丝分裂后（post-mitotic）培养人成纤维细胞重现并加速体内衰老特征并支持抗衰老化合物动态评估

《Aging Cell》：Long-Term Post-Mitotic Culture of Human Fibroblasts Recapitulates and Accelerates Features of In Vivo Aging and Enables Dynamic Testing of Anti-Aging Compounds

　　

生物衰老驱动细胞功能障碍和人类疾病，然而由于实验平台有限，研究人类衰老动态仍具挑战。研究人员展示，人成纤维细胞的长期有丝分裂后（post-mitotic）培养可重现并加速体内（in vivo）衰老特征。对四株女性成纤维细胞系进行纵向配对转录组和表观遗传分析显示，体外（in vitro）衰老反映了体内原代成纤维细胞衰老的关键特征。对体外衰老成纤维细胞进行直接神经元转化可保留生物学年龄，使研究人员能够通过直接重编程建立神经元衰老的伪纵向（pseudo-longitudinal）模型。对体外衰老成纤维细胞的单细胞转录组学分析显示，年龄异质性呈时间依赖性增加，这与既往报道的由体内转录程序可变丢失驱动的年龄相关异质性一致。利用该加速衰老平台，研究人员评估了抗衰老化合物：二甲双胍（Metformin）广泛减弱转录组和表观遗传衰老，而雷帕霉素（Rapamycin）疗效有限。这些发现与临床前证据一致，提供了一个在分子分辨率上评估和预测治疗性抗衰老化合物疗效的平台。该系统增进了对衰老机制的理解，并促进针对年龄相关疾病干预措施的开发。

生物衰老导致细胞功能下降、疾病增加和死亡风险升高。由于人类遗传与生理特殊性、寿命长及许多衰老相关疾病的人类特异性，动物模型的预测价值有限；而可动态研究人类细胞纵向衰老的模型仍缺乏。原代细胞培养和直接重编程（如直接诱导神经元（iNs, directly induced neurons））可建立供者/患者特异模型并保留体细胞特征，但横断面年龄等效模型不能揭示动态衰老过程或测试干预。化学应激、蛋白酶体抑制、衰老诱导或衰老相关因子过表达等可触发部分衰老通路，却难以覆盖细胞衰老的复杂范围。衰老速率依赖时间进展，长期存活且低增殖周转细胞（如有丝分裂后神经元和长寿命真皮成纤维细胞）中年龄相关变化积累尤为重要。因此，研究人员建立长期汇合、非复制性体外培养范式，以模拟成纤维细胞衰老中互补的、时间依赖和细胞内在成分，而非替代复制性衰老模型。

研究人员将来自33名0–92岁个体皮肤活检的原代人成纤维细胞用于体内衰老对照（第10代前收获），并将4名53、55、67和68岁女性供者成纤维细胞在汇合、不传代状态下培养6个月；每月采集5–7个时间点进行DNA甲基化（DNAm, DNA methylation）EPIC阵列和RNA测序（RNA-seq），并行单细胞RNA测序（scRNA-seq, single-cell RNA sequencing）及直接神经元转化。主要关键技术方法（不列试剂与具体培养/质粒构建步骤）：样本队列来源包括33名0–92岁供者皮肤活检原代成纤维细胞、4名53–68岁女性纵向体外衰老队列，以及Fleischer et al. 的143名1–96岁独立体内成纤维细胞队列；采用Blood&Skin DNAm时钟、RNAAgeCalc、tAge和RNAge等转录组年龄估计，KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）通路/ClueGO与纵向衰老（LTA, longitudinal aging）基因分析、负二项偏差（NB deviance）异质性分析，以及Ngn2/Ascl1诱导的iNs转化和PSA-NCAM流式分选；抗衰老处理为1 mM二甲双胍（Metformin）或25 nM雷帕霉素（Rapamycin）6个月。

2.1 长期体外培养重现体内成纤维细胞衰老特征：长期汇合接触抑制成纤维细胞形态稳定、无过度生长或细胞死亡，未出现p21/p16^INK4a免疫反应及衰老相关分泌表型（SASP, senescence-associated secretory phenotype）基因上调等衰老状态，且保留增殖和传代能力；DNAm与转录组时钟显示体外培养可捕捉体内成纤维细胞衰老特征。

2.2 体外衰老加速DNAm和RNA衰老时钟速度：纵向采样显示DNAm年龄随时间显著增加，平均衰老速度8.2×；tAge和RNAAgeCalc分别约22.5×和48.3×，转录组时钟较DNAm时钟快约3–5倍，且多个估计器一致捕捉转录组年龄增加。

2.3 体外衰老重现体内转录组衰老关键特征：与体内队列和Fleischer et al. 队列比较，体外衰老与体内衰老共享17条下调、7条上调KEGG通路；重叠通路在体外多倍加速，启动子DNAm与基因表达呈负相关，提示转录与DNAm衰老速度解耦但功能耦合。

2.4 性别和年龄分层对衰老转录组特征影响最小：性别调整与否结果高度重叠，年轻（<40岁）与年老（>40岁）组衰老速度无差异（R²=0.876），说明衰老特征稳健。

2.5 体外衰老成纤维细胞直接神经转化产生伪纵向iN模型：3名供者预衰老6个月后转化为iNs，转化效率未显著改变；iNs保留DNAm和转录组年龄增加（DNAm +4.2±1.7年；tAge +6.6±1.5年；脑特异RNAAgeCalc +21.5年），重铺后仍保留，支持单供者伪纵向神经元衰老建模。

2.6 单细胞RNA-seq揭示细胞异质性随年龄增加：2名67/68岁供者月0和5 scRNA-seq显示衰老评分向老年细胞偏移，LTA基因NB偏差升高且超过全局转录组，独立基因集交叉验证，提示衰老相关转录噪声和细胞间异质性增加。

2.7 Metformin而非Rapamycin显著改变衰老轨迹：6个月处理显示Metformin降低DNAm衰老速度（8.23×至?2.8×）和RNAAgeCalc速度（48.3×至11.0×），影响151个衰老基因并逆转多数下调通路；Rapamycin仅影响9个基因且通路效应有限。结果与临床前证据一致，支持平台评估抗衰老化合物。

讨论部分总结：长期纵向DNAm和转录组表征揭示体外衰老反映体内衰老多方面；加速时钟可在数月复制多年时间窗，且独立于细胞衰老；转录组时钟较DNAm快约5倍，提示转录程序对组织稳态约束丢失更敏感而DNAm积累更渐进，但应解释为读数相对分歧而非机制独立证据；单细胞异质性支持生物噪声是衰老主题。iNs保留年龄特征可生成伪纵向神经元样本，用于研究神经退行性疾病临床前时间窗。局限性包括：模型不能完全复制真实纵向研究，未纳入饮食、运动、应激、疾病或生活方式等环境与个体事件；单细胞NB偏差不能完全排除随机转录爆发或扩增伪影；仅测试一种化合物浓度，需专门研究最佳剂量；通路/基因变异可能来自供者人口学、队列大小和分析方法。

研究结论翻译：总之，研究人员的发现提示，起始成纤维细胞的体外衰老可用于在神经元转化前对这些细胞进行“预衰老”，从而从单一供者生成“伪纵向”神经元样本，特别适用于纵向活检不可行的情况。