鸡恒定链（chIi）–chVti1b关联及其在雷帕霉素处理HD11细胞中的自噬相关蛋白变化

《Poultry Science》：Chicken invariant chain–Vti1b association and changes in autophagy-related proteins

　　

抗原加工与提呈是宿主识别病原体并启动适应性免疫应答的关键步骤。该过程不仅依赖主要组织相容性复合体（MHC）分子及相关伴侣蛋白，还依赖内体运输、膜融合和自噬相关过程的协同活动。研究人员在本研究中聚焦鸡恒定链（chicken invariant chain，chIi）和鸡Vti1b（chVti1b），以检查二者的关联及自噬相关蛋白水平变化。研究人员采用共聚焦显微镜检查chVti1b在HD11细胞中的亚细胞定位及其与chIi的共定位；采用免疫共沉淀（co-immunoprecipitation，Co-IP）和pull-down实验评估chIi相关蛋白及Ⅱ类相关恒定链肽（class II-associated invariant chain peptide，CLIP）区域的贡献，同时采用液相色谱-串联质谱（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）和AlphaFold3/HDOCK分析鉴定并优选候选关联；采用Western blot检测自噬相关标志物和鸡Tax1结合蛋白1（chTAX1BP1）蛋白表达，采用逆转录定量PCR（reverse transcription quantitative PCR，RT-qPCR）分析所选免疫相关基因的转录水平。结果显示，chVti1b主要定位于晚期内体，并在HD11细胞中与chIi呈显著共定位。该共定位与较大的chIi/chVti1b阳性囊泡结构形成相关。双向Co-IP支持过表达的chIi与chVti1b在人293T细胞中存在相互作用，而CLIP缺失导致该系统中检测不到Co-IP信号。在雷帕霉素处理的HD11细胞中，相对于空载体对照，chVti1b与chIi共表达与p62下降58%、LC3-II升高34%及chTAX1BP1蛋白水平升高121%相关。chVti1b敲低降低BF2、BLB、IFN-γ和chIi的转录水平，而chVti1b过表达提高BLB、IFN-γ和chIi的转录水平，但对BF2无显著影响。综上，这些发现支持chIi与chVti1b之间存在相互作用，并显示二者共表达与雷帕霉素处理HD11细胞中自噬相关蛋白水平变化相关。

抗原加工与提呈是宿主识别病原体并启动适应性免疫应答的关键环节，依赖主要组织相容性复合体（MHC）分子及伴侣蛋白，也依赖内体成熟、囊泡融合、膜运输和自噬相关过程。恒定链（Ii；CD74）通过Ⅱ类相关恒定链肽（CLIP）占据MHCⅡ类分子肽结合槽，促进MHCⅡ类组装并引导其进入内体抗原加工区室；Ii还参与MHCⅠ类限制性交叉提呈和抗原递送。Vti1b是参与膜融合的可溶性N-乙基马来酰亚胺敏感因子附着蛋白受体（SNARE），与syntaxin 7、syntaxin 8和endobrevin/VAMP8形成复合物调节晚期内体融合，并参与晚期内体-溶酶体融合、高尔基体至晚期内体抗原运输及自噬体形成。哺乳动物中Ii可与Vti1b互作并参与内体融合与成熟调控，Tax1结合蛋白1（TAX1BP1）可影响Ii稳定性和MHCⅡ类装载区室；但禽类中chIi与chVti1b关系是否进一步联系自噬相关膜调控缺乏直接证据。为此，研究人员探讨chIi与chVti1b的关联、在鸡细胞中的定位及雷帕霉素（Rapa）处理下共表达后自噬相关蛋白水平变化，为研究chIi–chVti1b关联是否影响Ii相关抗原加工提供基础。

方法上，研究人员使用鸡巨噬细胞样HD11细胞、鸡胚成纤维DF-1细胞、鸡法氏囊B淋巴母细胞样DT40细胞和人胚肾293T细胞；DF-1与DT40购自ATCC，HD11与293T为实验室保存；抗chTAX1BP1多克隆抗体由新西兰白兔制备（伦理批准号AHAU 2024-132）。采用共聚焦显微镜和Pearson相关系数（PCC）评估亚细胞定位与共定位；采用双向免疫共沉淀（Co-IP）及His-chIi/His-chIiΔCLIP pull-down结合液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）筛查候选蛋白，并用AlphaFold3/HDOCK进行结构预测与分子对接优选；采用Western blot检测p62（p62蛋白）、LC3-II（微管相关蛋白1轻链3-II）和chTAX1BP1，采用逆转录定量PCR（RT-qPCR）检测BF2、BLB、IFN-γ、chIi及chVti1b转录水平，并结合小干扰RNA（siRNA）敲低和过表达分析。

结果部分保留以下小标题：（1）Vti1b氨基酸序列在鸡细胞类型间及跨物种间保守：HD11、DT40、DF-1来源Vti1b序列一致，均编码232个氨基酸；鸡Vti1b与鸭、鼠一致性分别为92.7%和65.9%，VTI1B结构域高度保守（与鸭、鼠分别为98.4%和90.3%），V-SNARE结构域保守性较低，支持其膜运输相关序列特征保守。（2）chVti1b主要定位于晚期内体并与chIi共定位：共聚焦显示GFP-chVti1b与mCherry-chRab5a、chRab7b共定位，PCC总体均值分别为0.7952和0.9538，与chRab7b更高；mCherry-chVti1b与GFP-chIi在24和36 h共定位，24 h多为小散在点状，36 h共定位信号数量减少但尺寸增大，形成较大囊泡样结构，对照未见类似重叠。（3）双向Co-IP支持293T细胞中chIi–chVti1b关联：293T共表达FLAG-chVti1b与Myc-chIi，输入泳道检测到预期大小蛋白；正向抗FLAG沉淀中检测到Myc-chIi，反向抗Myc沉淀中检测到FLAG-chVti1b，空载体对照无相应共沉淀信号，支持过表达系统中二者生化关联。（4）CLIP缺失降低可检测的chIi–chVti1b关联：以Myc-chIiΔCLIP替代Myc-chIi后，输入泳道检测到FLAG-chVti1b和Myc-chIiΔCLIP；WT chIi表达较chIiΔCLIP高11%（平均差0.75），差异不显著（P=0.75）；正反向Co-IP均检测不到共沉淀信号，支持CLIP含区对可检测关联的贡献。（5）LC-MS/MS与AlphaFold3/HDOCK分析优选候选chIi相互作用蛋白：His-chIi与His-chIiΔCLIP pull-down后银染显示差异条带；LC-MS/MS在His-chIi和His-chIiΔCLIP中分别鉴定568和484个蛋白，418个共有，150和66个分别独有；仅His-chIi检测到的150个蛋白用于探索性候选评估，结合AlphaFold3模型置信度与HDOCK对接评分手工优选8个候选，其中chVti1b HDOCK评分-307.31 kcal/mol、ipTM+pTM为0.56，被优先用于实验评估；原文强调该筛选为探索性，预测互作仍需生化验证。（6）雷帕霉素处理下chVti1b和chIi表达后的LC3-II与p62水平：293T在25 μM Rapa下，GFP-chVti1b随质粒剂量增加使p62/GAPDH最大下降72%、LC3-II/GAPDH最大升高49%（P<0.001），chIi单独无明显变化；共表达chVti1b+chIi相对空载使p62/GAPDH下降75%、LC3-II/GAPDH升高42%（P<0.001），单chVti1b分别为下降41%和升高34%。HD11在15 μM Rapa下，chVti1b单表达使p62/GAPDH下降38%、LC3-II/GAPDH升高28%，共表达使p62/GAPDH下降58%、LC3-II/GAPDH升高34%（P<0.001）；chVti1b过表达使chTAX1BP1升高53%，共表达升高121%（P<0.001）。（7）HD11细胞中chVti1b敲低和过表达后MHC相关及免疫相关转录变化：单条chVti1b siRNA使chVti1b mRNA降至对照17%，BF2、BLB、IFN-γ、chIi分别降至27%、32%、47%、72%（BF2、BLB、IFN-γ P<0.01，chIi P<0.05）；chVti1b过表达使chVti1b mRNA升高27倍，BLB、IFN-γ、chIi分别升高20%、70%、20%（P<0.05），BF2无显著变化，表明chVti1b敲低/过表达与所选MHC相关和免疫相关转录水平变化相关。

讨论部分指出，chVti1b晚期内体定位及与chIi共定位、双向Co-IP支持二者关联，但共定位仅说明空间重叠，Co-IP不能区分直接结合与蛋白复合物中的间接关联，鸡细胞内外源互作仍待验证；chVti1b序列在鸡源细胞系间一致、VTI1B结构域跨物种高度保守，为比较功能研究提供序列基础。CLIP缺失导致可检测Co-IP信号消失，支持CLIP含区贡献，但输入表达差异不显著并不能排除定位、构象或复合物稳定性影响，因此不能确立CLIP为直接结合界面。LC-MS/MS筛选缺独立生物重复和His-only对照，应视为探索性，预测界面仍需实验验证。Rapa处理下共表达与p62降低、LC3-II升高及chTAX1BP1升高相关，但不能证明自噬通量增加，chTAX1BP1功能贡献未定。转录变化不确立抗原提呈功能改变。局限包括缺乏抗原加工、提呈和抗原特异性T细胞活化直接功能证据，未在chIi表达背景耗竭chVti1b，单siRNA无救援验证，不能排除脱靶。研究结论翻译：总之，chVti1b与晚期内体关联，并在293T过表达系统中与chIi相互作用；HD11细胞中共定位及CLIP缺失后Co-IP信号检测不到进一步表征该关联；在雷帕霉素处理下，chVti1b与chIi共表达与HD11细胞中自噬相关蛋白变化相关。这些发现支持进一步研究禽免疫细胞中chIi–chVti1b关联，而其功能意义尚待确立。