家禽舍PM2.5来源物质序贯APEC暴露在鸡肺上皮与雏鸡模型中的炎症—氧化还原及CFTR相关分子关联

《Poultry Science》：Inflammatory and redox responses associated with sequential exposure to poultry-house PM2.5-derived material and avian pathogenic Escherichia coli in chicken models

　　

家禽舍中收集的细颗粒物（PM_2.5）和禽致病性大肠杆菌（APEC）是鸡的呼吸道应激源，但对有序暴露日程的反应尚未完全明确。研究人员检查了从肉鸡舍PM_2.5组分收集并随后洗脱、冻干和高压灭菌的材料（PM_2.5来源物质）以及APEC O1:K1分离株。将鸡胚II型样肺上皮细胞分配至对照、加工PM_2.5来源物质、APEC或PM_2.5后APEC日程；使用N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）和4-氯苯并[f]异喹啉（CBIQ）作为药理学干预。在体内，40只供应商认证的无特定病原体（SPF）雏鸡（7日龄到达；10日龄开始处理；n = 10/组）接受对照、单次暴露或序贯日程14 d。在这些预设日程下，序贯组在若干炎症和氧化还原相关终点显示最大变化、较低的囊性纤维化跨膜电导调节因子（CFTR）丰度、PI3K、AKT、mTOR、IκBα和NF-κB p65总丰度改变，以及LC3B和MDC相关标志物积累增加。NAC和CBIQ使选定细胞反应向对照值偏移。雏鸡血清炎症/氧化还原指标和定性肺组织学与选定细胞发现方向一致。加工材料在灭菌后未对粒径分布、元素/离子组成或内毒素含量进行表征，且各日程暴露时长和时点不同。因此，这些数据描述测试日程下的关联，不能建立PM_2.5 × APEC交互作用、统计学协同、因果启动、颗粒特异性效应或通路激活。未来需要使用完全表征的颗粒制备物以及临床和微生物学终点开展析因研究。

家禽舍PM_2.5（空气动力学直径≤2.5 μm细颗粒物）是含有机物、无机物、微生物及内毒素的复杂混合暴露，可关联氧化应激、上皮屏障破坏和免疫失调；APEC（禽致病性大肠杆菌）可引起禽大肠杆菌病。既往有家禽舍PM_2.5与铜绿假单胞菌组合增强炎症反应的报道，但PM_2.5先暴露后APEC暴露在鸡肺上皮中的反应尚不明确。作者指出，PM_2.5来源材料处理后未对粒径、元素/离子组成和内毒素进行表征，且各日程暴露时长和时点不匹配，因此不能估计PM_2.5 × APEC交互、协同或因果启动。Luna Li、Cheng Bao等开展预设日程比较，在鸡胚II型样肺上皮细胞和SPF雏鸡中比较对照、PM_2.5、APEC及PM_2.5后APEC序贯暴露，并用NAC（N-乙酰-L-半胱氨酸）和CBIQ（4-氯苯并[f]异喹啉）进行药理学干预。结论为：在测试日程下，序贯组若干炎症和氧化还原相关终点变化较大，CFTR（囊性纤维化跨膜电导调节因子）丰度降低，PI3K（磷脂酰肌醇3-激酶）、AKT（蛋白激酶B）、mTOR（雷帕霉素机制靶点）、IκBα（NF-κB抑制蛋白α）和NF-κB p65（核因子κB p65亚基）总丰度改变，LC3B（微管相关蛋白1轻链3β）和MDC（单丹磺酰尸胺）相关标志物积累增加，NAC和CBIQ使选定反应部分向对照值偏移；但这些仅为测试日程下的描述性关联，不建立颗粒特异性效应、交互、因果启动或通路激活。其意义在于为后续完全表征颗粒、匹配析因设计及临床和微生物学终点研究提供依据。

主要关键技术方法（不超过250字）：PM_2.5采自山东烟台福山肉鸡舍（2022年两轮，ZR-3920采样器，100 L/min），经洗脱、冻干、混合、高压灭菌。APEC O1:K1为实验室鸡肺源分离株，经血清型和全基因组测序鉴定。取18日龄SPF鸡胚肺组织，经酶消化、差速贴壁、IgG包被去巨噬和过滤分离II型样肺上皮细胞，以BCIP/NBT及RT-PCR检测LAMP3、SFTPC、SFTPA1、FABP3。细胞按0.50 mg/mL PM_2.5、MOI 100:1 APEC及2 h+2.5 h序贯，NAC 5 mM或CBIQ 10 μM预处理1 h；用ELISA、氧化还原/损伤指标、qRT-PCR、Western blot和MDC染色。动物用40只SPF Yisheng 909雏鸡（山东益生，7日龄到达，10日龄开始，n=10/组），鼻滴200 μL/只14 d，检测血清、肺H&E（苏木精-伊红）及肺qPCR/WB；one-way ANOVA+Tukey。

研究结果：
（1）测试PM_2.5和APEC暴露日程下的炎症与氧化还原相关反应。细胞上清ELISA和氧化还原/损伤指标显示，单暴露与序贯暴露均改变TNF-α（肿瘤坏死因子α）、IL-1β（白细胞介素1β）、MCP-1（单核细胞趋化蛋白1）、ROS（活性氧）、SOD（超氧化物歧化酶）、CAT（过氧化氢酶）、GSH（谷胱甘肽）和AST（天冬氨酸氨基转移酶）；序贯组TNF-α高于对照和两个单暴露组，MCP-1高于对照和PM_2.5组，ROS均值最高且与对照和单暴露组差异显著，AST高于对照和两个单暴露组。作者据这些比较描述测试日程下的关联，不估计PM_2.5×APEC交互。
（2）PM_2.5后APEC序贯与CFTR及炎症相关转录本和总蛋白丰度改变相关。qRT-PCR和Western blot显示，序贯组CFTR转录和总蛋白低于对照，暴露组中均值最低；PI3K、AKT、mTOR转录和总蛋白低于对照，序贯组低于对照并与部分单暴露组有差异；NF-κB p65转录和总蛋白高于对照，IκBα总蛋白高于对照；但无磷酸化或核转位测量，不证明NF-κB激活。
（3）PM_2.5后APEC序贯与自噬相关标志物积累相关。Western blot显示序贯组LC3B最高，高于对照和两个单暴露组；MDC荧光高于对照和单暴露组，表明自噬相关结构积累；未测自噬通量，不能区分自噬体形成增加或下游降解受损。RT-PCR检测LAMP3、SFTPC、SFTPA1、FABP3为细胞表型提供转录水平证据。
（4）NAC和CBIQ部分减弱与序贯PM_2.5和APEC暴露相关的选定反应。预处理后TNF-α、IL-1β、MCP-1、ROS和AST降低，SOD、CAT、GSH部分向对照值改变；说明选定终点具药理可改性，但不识别唯一上游机制。
（5）NAC和CBIQ部分减弱与PM_2.5后APEC序贯暴露相关的选定分子反应。序贯暴露相关CFTR、PI3K、AKT、mTOR转录和蛋白下降，NAC或CBIQ不同程度提高；NF-κB p65、LC3B、IκBα在序贯暴露升高，干预后降低；变化幅度随终点和干预而异。
（6）PM_2.5后APEC序贯与雏鸡定性肺组织学及血清炎症/氧化还原反应相关。H&E描述性观察显示对照肺结构较完整，单暴露可变，序贯组更广泛异常，包括肺组织结构破坏和炎症样特征；无死亡，无预设临床评分；血清TNF-α、IL-1β、MCP-1、ROS和T-AOC（总抗氧化能力）在序贯组高于对照，部分与单暴露组有差异；不量化临床疾病或病变严重度。
（7）PM_2.5后APEC序贯与雏鸡肺CFTR及炎症相关分子丰度改变相关。肺qPCR和Western blot显示CFTR、PI3K、AKT、mTOR、NF-κB p65转录及CFTR、PI3K、AKT、mTOR、LC3B、IκBα、NF-κB p65总蛋白在不同日程有差异，选定模式与细胞模型方向一致，提示跨系统可重复响应模式。

讨论部分总结：作者强调加工PM_2.5来源材料未表征，高压灭菌非去热原，热稳定脂多糖可能残留，反应不能归因于颗粒本身；细胞和雏鸡日程不匹配，不能解释协同或因果启动；SOD、CAT、GSH和T-AOC升高不证明氧化负荷降低；NAC多作用，不能证明ROS为唯一驱动；CFTR功能、氯转运、膜定位和气道表面液体未测，CBIQ非完全选择性；总丰度不能证明PI3K/AKT/mTOR或NF-κB激活；自噬通量未测；雏鸡缺预设临床评分、病变评分、载菌/菌血症和生长指标；细胞缺活力/LDH、AST非特异、蛋白水平谱系验证不足，生物重复为3批独立细胞分离。

研究结论翻译：在测试日程下，序贯暴露于加工家禽舍PM_2.5来源物质和APEC与明显的炎症/氧化还原反应模式以及CFTR相关、炎症相关和自噬相关分子测量改变相关；药理学干预改变了选定细胞终点，但该研究不能建立颗粒特异性效应、PM_2.5 × APEC交互、因果启动或通路激活。研究结果支持进一步用完全表征的颗粒制备物、匹配的析因设计和临床相关家禽健康终点研究家禽舍生物气溶胶暴露与APEC压力如何交汇。