《Cell Biochemistry and Function》：Mechanisms of Tumor Cell Invasion: Insights From the Perspective of Epithelial-to-Mesenchymal Transition
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中文摘要翻译：
肿瘤侵袭意味着细胞运动能力异常增强，是最终导致远处转移发生的一系列级联事件中的第一步。由本质上静止的细胞构成的上皮癌获得迁移能力，与上皮-间质转化（epithelial-to-mesenchymal transition，EMT）程序的激活密切
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肿瘤侵袭意味着细胞运动能力异常增强，是最终导致远处转移发生的一系列级联事件中的第一步。由本质上静止的细胞构成的上皮癌获得迁移能力，与上皮-间质转化（epithelial-to-mesenchymal transition，EMT）程序的激活密切相关，该程序的范围可从部分EMT到完全EMT。根据EMT模型，癌细胞会削弱细胞-细胞连接，并将基底伪足延伸至间质中，与那里的细胞外基质（extracellular matrix，ECM）形成黏附接触；最终，细胞骨架收缩，导致细胞移入下方的间质，从而启动对基质的实际侵袭。所谓的间质样迁移（mesenchymal migration）意味着细胞前端出现突起，细胞体和后端产生收缩活性，从而有效地将细胞向前拉动。Rho家族小GTP酶在EMT及细胞迁移/侵袭中发挥关键作用。Rac的活性导致外周肌动蛋白网络的形成，该网络在细胞前端对细胞膜产生推力，导致形成与基质建立黏附的细胞质延伸。最终，细胞体向前移动是由Rho介导的肌动球蛋白收缩性产生的，该收缩性在底物上产生牵引力。第二种单细胞迁移策略称为阿米巴样迁移（ameboid migration），依赖于细胞骨架的强烈收缩性，产生高细胞质压力，从而推动细胞向前推进。第三种侵袭模式是集体迁移（collective migration），即肿瘤细胞簇的移位，这得益于位于前端的、经过部分EMT转化的“领导者”细胞引导其后的“追随者”细胞群。事实上，虽然基于单细胞的间质样和阿米巴样侵袭依赖于完全EMT，但集体侵袭依赖于部分EMT。然而，根据微环境背景的不同，肿瘤细胞可以在这些迁移模式之间可塑性地切换。
论文主体内容总结：
1 引言
上皮组织和间质组织存在于几乎所有器官中，各自具有不同的特征并发挥多样化的生物学功能。上皮细胞通过细胞间连接紧密排列，显著限制了其运动能力；而间质细胞通常不与其他细胞形成连接，但与细胞外基质（ECM）关系密切，可在其中移动。形态学上，上皮细胞呈单层或鹅卵石样聚集，具有顶-基底极性，基底极通过整合素介导的黏附复合物和半桥粒与基底膜相连。基底膜为上皮提供稳定性和底物支持，同时也构成限制其运动性的物理屏障。相比之下，间质细胞呈星状或梭形，富含波形蛋白（vimentin）中间丝，与ECM建立动态的黏附、去黏附和重塑关系，通过整合素受体与ECM相互作用，并可产生基质金属蛋白酶（MMPs）降解基质或合成纤连蛋白（fibronectin）等ECM成分。迁移中的间质细胞具有前-后极化特征，在前缘形成运动性伪足突起。因此，迁移能力是区分可运动的间质细胞与相对静止的上皮细胞的基本特征。
癌是人类最常见的实体肿瘤，由恶性转化的上皮细胞组成，但仍保留大部分原始特征，包括聚集成实体结构的能力和有限的运动能力。癌遵循实体瘤的典型生物学演变过程，即肿瘤细胞从原发部位迁移并播散至全身，在远处继发部位形成新的肿瘤灶，即众所周知的转移级联。因此，上皮-间质转化（EMT）代表了从上皮表型向间质表型的形态-功能转换的多方面生物学过程，还包括获得干样特征和抗凋亡能力等额外特性。EMT发生在胚胎发育、成体生理环境（如组织修复）以及病理情况（如癌症进展）中。
2 EMT的一般特征
EMT是一种生物学程序，主要在胚胎发生过程中用于产生具有迁移能力的细胞（1型EMT），也用于成体伤口愈合（2型EMT）和癌症发展及进展（3型EMT）。EMT指上皮向间质表型的可逆转变，而相关逆过程——间质-上皮转化（MET）——则定义EMT产生的细胞回到上皮状态的过程。然而，EMT和MET过程可以非常流动，沿上皮-间质轴存在中间、不完全或混合形式，即部分EMT（partial EMT）。
EMT程序通过细胞生理学的多种变化实现：（i）细胞间黏附减少；（ii）上皮顶-基底极性丧失；（iii）细胞骨架动态重组以增加运动性；（iv）基底膜降解；（v）细胞从起源上皮移位至间质。EMT的分子标志包括：EMT诱导转录因子（EMT-TFs）上调；E-钙黏蛋白（E-cadherin）下调，导致细胞间黏附松弛；Rho GTP酶驱动的细胞骨架重构；降解基底膜的MMPs上调；细胞角蛋白（cytokeratin）中间丝及其他上皮相关标志物（如claudins和occludin）丧失，并重新表达间质标志物，包括N-钙黏蛋白（N-cadherin）、波形蛋白和纤连蛋白。部分EMT已被证实在癌症演变的许多阶段发挥重要作用，包括侵袭、抗凋亡、干性和癌症干细胞（CSC）的产生、代谢重编程、对抗癌治疗的耐受、免疫逃逸、增强的转移潜能以及与不良预后的关联。
2.1 EMT的分子机制
EMT由微环境信号触发，多数情况下是缺氧、生长因子、细胞因子或基质驱动的细胞表面受体激活，或刺激其下游信号组分，如受体酪氨酸激酶（RTK）/RAS/RAF/MEK/ERK、RTK/PI3K/AKT、Wnt/β-catenin、TGFβ/Smads、Jagged/Notch、JAK/STAT、Hedgehog和Hippo信号转导通路。所有这些分子级联最终导致EMT-TFs的关键性上调，包括Snail、ZEB和Twist家族，它们通过招募各种共抑制复合物至相应启动子基因，抑制维持上皮表型的关键基因转录。EMT-TFs还激活编码间质标志物（如波形蛋白、N-钙黏蛋白、纤连蛋白和MMPs）的基因转录。此外，EMT受另一组转录因子（有时称为MET转录因子）调控，如OVOL1/2和GRHL2等，它们帮助维持上皮表型、促进上皮化，并通过与EMT-TFs的抑制性反馈环发挥作用，可导致混合E/M中间态的稳定。EMT还受表观遗传修饰和效应蛋白翻译后修饰的显著影响，以及非编码微小RNA（miRNAs）的负调控，如miR-200家族负向靶向ZEB1和ZEB2，而ZEB1和ZEB2又下调miR-200，形成双负反馈环。TGFβ是最重要的EMT诱导因子之一，可激活多种细胞内通路，包括经典Smad级联、RAS/RAF/MEK/ERK、Rho-GTPase和PI3K/AKT通路。
2.2 癌细胞可塑性与EMT
干性和可塑性的增加是肿瘤进展的主要原因之一，包括异质性发展和大多数类型治疗的适应性耐药。E/M状态的可塑性与癌细胞播散之间存在相关性。越来越多的证据表明，部分EMT的混合E/M状态比完全E或M状态对转移更重要，因为部分EMT表型有利于不同可塑性状态间的转化，增加细胞对转移进展中可能遇到的各种场景的灵活性。具有更高干性特征的细胞位于E/M分化轴的中间位置，在这些细胞中，干性与恶性肿瘤的许多特征相关，包括肿瘤起始、高表型可塑性、肿瘤细胞异质性、侵袭、转移性生长以及治疗后疾病复发。
3 EMT与转移级联中的侵袭
侵袭是最终导致转移发展的生物学事件级联中的第一步。癌本质上具有非常有限的运动潜能，因此被认为激活EMT程序以获得运动和浸润瘤周组织所需的运动能力。预示即将发生侵袭的EMT事件发生在肿瘤-基质界面，包括恶性细胞从原发肿瘤灶周边初始脱离和移位至紧邻下方的间质结缔组织，这一过程需要MMP介导的基底膜蛋白水解。转移级联通过精确的事件序列发生：（i）EMT驱动的肿瘤细胞移出原发肿瘤边界；（ii）浸润原发肿瘤周围组织并与基质细胞相互作用；（iii）穿入血管或淋巴管（内渗）；（iv）从血管逸出（外渗）；（v）浸润并在远处器官定植；（vi）最终继发转移灶的生长。
在瘤周间质组织中，侵袭细胞与基质和基质细胞相互作用，产生加速侵袭并进一步支持EMT本身的肿瘤微环境（TME）。肿瘤细胞诱导局部基质成纤维细胞转化为癌症相关成纤维细胞（CAFs），协助肿瘤细胞侵袭，并与TGFβ共同促进ECM的促侵袭重塑。侵袭性肿瘤的修饰基质常以基质硬化和ECM纤维排列为特征，为侵袭创造路径。活化的基质巨噬细胞（包括肿瘤相关巨噬细胞，TAM）产生促侵袭、促炎和促血管生成因子，促进新血管形成，为通过循环的远处肿瘤播散奠定基础。
癌细胞可通过两种方式完成侵袭：单细胞或细胞聚集体。单细胞迁移包括两种主要亚型：间质样和阿米巴样模式。
3.1 间质样迁移
这种迁移类型因被成纤维细胞和间质来源肿瘤使用而得名，特征是迁移细胞呈细长形态、前-后极化、前缘形成富含肌动蛋白的运动性突起、与ECM的动态黏附、肌动球蛋白收缩在细胞-ECM黏附接触处产生牵引力，以及MMP介导的细胞周蛋白水解。癌中的这种迁移类型与完全EMT的发生明确相关。在间质样迁移中，前缘细胞突起的出现是正在进行运动的明确标志。新生的突起通过建立连接细胞骨架与ECM的黏附性细胞-ECM接触而稳定化。利用这些细胞-ECM黏附作为牵引点，细胞骨架收缩和回缩，导致细胞向前移动。此外，前缘的局部细胞周ECM蛋白水解为迁移细胞创造通路。突起活动包括片状伪足（lamellipodia）和丝状伪足（filopodia）两种基本类型的细胞运动性附属结构。此外，侵袭足（invadopodia）是前缘富含肌动蛋白的细胞质突起，常见于肿瘤细胞，专门降解ECM屏障。
3.1.1 间质样迁移机制
当间质样迁移细胞移动时，其极化决定迁移方向，细胞突起确定前端，细胞骨架收缩定义后端。Rho GTP酶家族的三个成员Rac、Cdc42和Rho分别调控这些亚细胞区室中的力：产生突起的推力在前端运作，由Rac和Cdc42控制；依赖收缩的拉力在后端活跃，由Rho调控。肌动蛋白聚合由Arp2/3复合物（介导分支网络形成）和mDia formin家族（促进线性无分支肌动蛋白束形成）介导。Rac和Cdc42作用于Arp2/3复合物和mDia formins，分别负责片状伪足和丝状伪足的形成。细胞移位所需的牵引力由非肌球蛋白II（non-muscle myosin II）的收缩产生，其功能受Rho调控：Rho激活Rho相关激酶（ROCK），ROCK直接磷酸化并激活非肌球蛋白II（MLC）并抑制肌球蛋白轻链磷酸酶（MLCP），导致肌动球蛋白收缩性增强。Rho还通过激活mDia formins促进无分支肌动蛋白聚合，并参与黏着斑（focal adhesions）形成和拆卸的控制。黏着斑包含多种结构和信号分子，如talin、paxillin、vinculin、黏着斑激酶（FAK）和Src酪氨酸激酶等，将ECM组分通过整合素聚集与肌动蛋白细胞骨架连接。Src显著参与黏着斑动力学和侵袭的调控。Rho/ROCK介导的肌动球蛋白收缩性在感知基质硬度中发挥作用，并参与具有排列纤维基质的肿瘤细胞侵袭。前缘肌动蛋白聚合的重要功能是促进膜型1 MMPs（MT1-MMPs）招募至“肌动蛋白热点”，将肌动蛋白聚合与靶向位点的细胞周ECM降解结合，协调空间事件并促进迁移/侵袭。
3.2 阿米巴样迁移
根据特定微环境条件，经历完全EMT的肿瘤细胞可保持细长形态并以间质样方式侵袭周围基质，或呈现圆形形态并通过阿米巴样模式侵袭。阿米巴样迁移可被视为EMT谱系中的特定状态，特征为高Rho/ROCK依赖性肌动球蛋白介导的收缩活性。这种运动类型依赖快速、高度动态的机制，特征是对ECM黏附和降解的依赖性低，单肿瘤细胞通过阿米巴样、挤压和推进运动克服基质屏障。阿米巴样细胞产生质膜泡状突起（blebs），这是由强收缩性产生的高静水压所致，独立于肌动蛋白聚合。阿米巴样细胞不降解ECM，而是优先推开ECM纤维并通过孔隙和间隙穿行，对预先存在的基质结构表现出灵活的形状适应。一种称为叶状伪足迁移（lobopodial migration）的特殊运动类型结合了阿米巴样和间质样迁移，依赖肌动球蛋白的强收缩性和细胞核的活塞式向前运动。
3.3 集体细胞迁移
这种迁移类型在形态发生和伤口愈合中频繁观察到，是高效的细胞移位方式，速度超过单细胞迁移。癌倾向于比完全EMT依赖的间质样迁移更频繁地利用集体迁移，是大多数上皮肿瘤中常见观察到的侵袭类型。其特征是细胞簇从原发肿瘤分离并浸润周围基质，同时保留将细胞连接在一起的细胞间连接。在癌进展前沿的组织学切片中可容易识别，观察到称为“肿瘤出芽”（tumor budding）的形态学模式，表现为已脱离或正在脱离原发肿瘤周边的小聚集黏附细胞。簇中细胞保留大部分基于E-钙黏蛋白的细胞间连接和桥粒，聚集体作为极化功能单位移动，特征是位于细胞群前端的移动性强的“领导者”细胞，而其后其余细胞被拖拽。领导者细胞经历了部分EMT，通过极化突起和牵引活动为整个群体提供运动，而尾随区域细胞保留上皮特征，运动性低得多。领导者细胞具有细长形态和前-后极性，具有与间质样迁移特征相同的Rac和Cdc42驱动的富含肌动蛋白的突起。领导者细胞在后极产生强牵引力并传递给其后的追随者细胞，还负责感知微环境并施加运动方向和速度，并产生MMPs降解和重塑ECM，创造促进细胞群前进的“微通道”。追随者细胞并非被动乘客，通过收缩肌动球蛋白细胞骨架产生推进力帮助推动整个细胞群前进。
癌细胞可通过血液或淋巴管以完全EMT产生的单个CTC或部分EMT产生的CTC簇形式行进。多细胞CTC比单细胞CTC具有优势，肿瘤栓子可掺入巨噬细胞提供生长因子，并被血小板包裹提供保护。多细胞CTC簇比单个CTC更有效地外渗，到达最终远处部位时更有可能扎根，因此比完全EMT衍生的单个CTC更有效地形成继发肿瘤。
3.4 迁移可塑性
根据环境背景，肿瘤可从一种迁移类型可塑性地转换为另一种，有证据表明这种可塑性与更有效的播散相关。ECM物理结构的变化可显著影响肿瘤的侵袭行为。最著名的迁移变化之一是间质-阿米巴转变（MAT），被认为与转移发展和癌症进展风险增加相关。MMP抑制剂可能作为有前景的抗侵袭药物，但实际上效果有限，因为它们减少间质样迁移但不减少阿米巴样迁移。逆过程阿米巴-间质转变（AMT）可在细胞收缩性降低的条件下发生。MAT和AMT受Rac和Rho之间的相互抑制环路控制：增强的Rac活性有利于肌动蛋白基突起形成和细长细胞形态，而高Rho/ROCK/肌动球蛋白通路活性促进泡状突起形成和阿米巴样迁移。ECM特征影响肌动球蛋白功能和迁移，增加的基质硬度被肿瘤细胞感知并导致增强的Rho依赖性肌动球蛋白收缩性和间质样迁移促进；但如果达到高物理限制条件，可触发MAT。此外，阿米巴样细胞可出现在集体迁移的细胞簇中（集体-阿米巴转变，CAT）。
3.5 细胞外囊泡在EMT、肿瘤侵袭和转移中的作用
细胞外囊泡（EVs）是由脂质膜包围的小结构，释放至细胞外空间和体液中。其生物活性内容物直接代表产生它们的细胞的生理或病理状态，可转移至其他邻近或远处细胞，传递信息物质并影响受体细胞行为。EVs对多种生理和病理过程至关重要，在调节EMT以及肿瘤侵袭和转移阶段发挥核心作用。肿瘤细胞来源EVs的释放通过与其他肿瘤细胞和非肿瘤细胞的相互作用，对恶性肿瘤相关信息的播散很重要。它们作为细胞间信使，启动、增强和维持EMT、侵袭和转移等过程，通过递送各种生物活性分子（包括促EMT介质和调控RNA）至肿瘤细胞以及基质、免疫和内皮细胞。因此，EVs可激活EMT、重塑ECM和免疫景观，作用于内皮细胞生理学改变其通透性并诱导血管生成，参与产生促进局部侵袭和内渗的促肿瘤TME，以及为远处转移定植准备远处组织。
