新型乙基1-羟基-3-氧代-1-苯基异吲哚啉-2-磺酸酯选择性抑制hCA IX/XII、诱导铁死亡介导乳腺癌细胞死亡及其结构机制研究

《Cell Biochemistry and Function》：Inhibitory, Anticancer Efficacy and Structural Insights of a Novel Ethyl 1-Hydroxy-3-Oxo-1-Phenylisoindoline-2-Sulfonate Compound Selectively Targeting Human CA IX and CA XII Carbonic Anhydrase, Ferroptosis-Mediated Cell Death

　　

碳酸酐酶（CA）同工酶IX和XII因在调节pH和缺氧条件中发挥重要作用，在抗癌药物开发中至关重要。本研究评估了通过点击化学合成的乙基-1-羟基-3-氧代-1-苯基异吲哚啉-2-磺酸酯（1）对hCA IX和hCA XII的抑制潜力。采用细胞活力、氧化应激和分子水平相结合的方法，研究该化合物对人乳腺癌（MCF-7细胞）的细胞效应。该化合物表现出比乙酰唑胺（AAZ）更强的抑制活性，对hCA IX和hCA XII的K_i值分别为11.48 ± 4.18 nM和9.32 ± 2.35 nM。该化合物对hCA IX具有更高的结合亲和力，对接评分为?8.8 kcal/mol。虽然对MCF-10A细胞未观察到细胞毒性作用，但在癌细胞中观察到细胞活力显著呈剂量依赖性降低，并证实膜完整性丧失。较高浓度下活性氧（ROS）水平降低，表明毒性不依赖于ROS产生。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）和微管相关蛋白1轻链3B（LC3B）表达在中等浓度下显示强阳性，提示凋亡和自噬通路激活。谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）和转铁蛋白受体（TFRC）荧光强度显著降低，表明氧化还原稳态和铁代谢受到破坏。这些发现表明，该化合物是开发靶向肿瘤相关CA同工酶的下一代抗癌剂的有前景的先导分子。

研究背景：异吲哚啉酮（isoindolinone）衍生物因结构多样、易功能化及广谱药理活性而受到关注。碳酸酐酶（CA，EC 4.2.1.1，催化CO₂可逆水合为碳酸氢盐和质子的酶）参与pH调节、电解质平衡、呼吸、代谢调节、骨吸收和肿瘤进展。膜结合同工酶hCA IX和hCA XII与肿瘤缺氧密切相关，在正常组织中表达低、在缺氧实体瘤中高表达；抑制hCA IX/XII可抑制肿瘤微环境酸化、降低肿瘤细胞增殖并增强癌细胞对化疗的敏感性。乳腺癌仍是全球健康挑战，需要明确作用机制的新型治疗策略。原研究指出，现有文献多聚焦hCA I和hCA II，因此研究人员评估乙基1-羟基-3-氧代-1-苯基异吲哚啉-2-磺酸酯（化合物1）对hCA IX和hCA XII的抑制活性、分子对接特征，并在MCF-7雌激素受体阳性luminal乳腺癌细胞中检测活力、膜完整性、氧化应激和细胞死亡相关标志物；同时在非肿瘤性乳腺上皮细胞中进行比较以初步评估安全性。该研究的意义在于为靶向肿瘤相关CA同工酶的下一代抗癌先导分子提供依据。

关键技术方法：研究人员采用Verpoorte法以4-硝基苯乙酸酯为底物测定hCA IX/XII酯酶活性，并通过不同底物和抑制剂浓度进行动力学实验，构建Michaelis–Menten曲线和Lineweaver–Burk图，计算抑制常数（K_i）并判定抑制类型；采用WST-1（水溶性四唑盐，检测细胞代谢活性）和乳酸脱氢酶（LDH，细胞膜损伤时释放的酶）法检测MCF-10A（ATCC-CRL-10317）和MCF-7（ATCC HTB-22）细胞活力与膜完整性；采用DCFH-DA（2′,7′-二氯荧光素二乙酸酯）和DHE（二氢乙锭）荧光探针检测ROS；采用免疫荧光检测Caspase-3、LC3B、GPX4和TFRC；采用CB-DOCK/AutoDock Vina对hCA IX（PDB ID: 6FE2）和hCA XII（PDB ID: 8CO3）进行分子对接。细胞实验在常氧条件下进行，无临床样本队列。

研究结果：

3.1 碳酸酐酶抑制结果（Carbonic Anhydrase Inhibition Results）：通过分离酶酯酶活性抑制实验和动力学分析，化合物1对hCA IX的半数抑制浓度（IC₅₀）为12.15 nM、K_i为11.48 ± 4.18 nM；对hCA XII的IC₅₀为13.07 nM、K_i为9.32 ± 2.35 nM。相同实验条件下，AAZ对hCA IX和hCA XII的K_i分别为20.89 ± 1.72 nM和18.16 ± 0.88 nM，化合物1抑制活性强于AAZ。与Yaz?c?o?lu等既往报道的同一化合物（曾称2a）对hCA I和hCA II的数据比较，化合物1对hCA IX/XII约呈1.9–2.4倍偏好，属于适度优先抑制而非严格同工酶选择性。讨论指出，酶抑制实验采用分离酶，不能直接建立细胞靶点结合；hCA IX在正常组织表达受限、在缺氧肿瘤中强诱导，hCA XII也在正常上皮和乳腺癌中呈亚型依赖表达，因此需结合细胞选择性和安全性解读。

3.2 细胞毒性与抗癌活性（Cytotoxicity and Anticancer Activity）：通过WST-1和LDH实验，在6.25–500 μg/mL范围内，MCF-10A细胞在低、中浓度活力接近对照，最高浓度约80%，未达到IC₅₀；MCF-7细胞活力随浓度增加逐渐降低，高浓度降低显著（p<0.0001），IC₅₀为86.553 μg/mL，细胞外LDH增加提示血浆膜完整性丧失。讨论强调细胞实验在常氧、无缺氧诱导条件下进行，CA IX在常氧下表达较低，MCF-7可能组成性表达CA XII，因此细胞毒效应不能特异归因于细胞CA IX抑制，可能涉及CA XII抑制、CA非依赖机制或与其他分子靶点相互作用。

3.3 ROS形成（ROS Formation）：通过DCFH-DA和DHE探针检测，低浓度化合物未显著改变ROS水平；在125–500 μg/mL高浓度下，DCFH-DA和DHE荧光信号显著降低（p<0.0001）。作者认为高浓度细胞毒效应不依赖ROS过产生；ROS降低可能与化合物高浓度抗氧化作用有关，也可能与严重细胞毒性和膜损伤导致探针滞留减少、代谢活性降低及活细胞数减少有关。

3.4 免疫荧光染色（Immunofluorescence Staining）：在MCF-7细胞中检测Caspase-3、LC3B、GPX4和TFRC。Caspase-3和LC3B在阴性对照、125 μg/mL和250 μg/mL组呈强阳性，500 μg/mL组呈轻度阳性，提示中等浓度主要激活凋亡和自噬，最高浓度下凋亡和自噬信号可能受抑并转向其他死亡通路。GPX4和TFRC在阴性对照和125 μg/mL组为中等阳性，在250和500 μg/mL组为轻度阳性，提示氧化还原稳态和铁代谢破坏；作者认为高浓度下细胞死亡转向铁死亡相关通路，并称首次显示该化合物处理导致铁死亡特征。

3.5 分子对接（Molecular Docking）：化合物与hCA IX的Vina对接评分为?8.8 kcal/mol、空腔体积803 ?³；与hCA XII为?7.8 kcal/mol、636 ?³；AAZ对hCA IX和hCA XII分别为?6.7和?7.6 kcal/mol。hCA IX中，磺酰氧与GLN249、ARG246，酯氧与SER155形成氢键，苯环与TRP16形成π–π T形接触、与ARG246形成π-烷基作用，并与ALA247形成π供体氢键；hCA XII中，酯氧与GLU247形成氢键，PHE8参与π–π堆积和π–π T形作用，ARG246和ILE249形成π-烷基作用及范德华网络。结果支持化合物对hCA IX具有较高预测结合亲和力，并为后续实验验证提供机制依据。

讨论部分总结：讨论指出hCA IX和hCA XII是缺氧肿瘤相关靶点，但酶抑制数据需与细胞选择性和安全性结果结合解读；常氧MCF-7细胞中CA IX表达较低，细胞毒效应不能特异归因于CA IX抑制，可能涉及CA XII抑制、CA非依赖机制或其他靶点；高浓度ROS降低可能与膜损伤、探针滞留减少、代谢活性和活细胞数下降有关；未来需在常氧和缺氧条件下使用侵袭性乳腺癌模型（如MDA-MB-231）并直接测定hCA IX/hCA XII表达、活性和同工酶特异靶点结合。

研究结论翻译：本研究中，乙基1-羟基-3-氧代-1-苯基异吲哚啉-2-磺酸酯对分离的肿瘤相关碳酸酐酶hCA IX和hCA XII表现出强抑制活性。分子对接进一步支持其与两种同工酶具有有利的预测相互作用。在MCF-7细胞中，该化合物呈浓度依赖性降低代谢活性和膜完整性，并改变Caspase-3、LC3B、GPX4和TFRC的免疫荧光谱，提示多种细胞死亡相关过程参与。在非肿瘤性乳腺上皮细胞中的评估也有助于初步判断该化合物的细胞选择性和安全性。然而，由于细胞实验在常氧条件下进行，且未直接测定细胞hCA IX/hCA XII表达和靶点结合，观察到的细胞毒性不能特异归因于hCA IX抑制。细胞反应可能涉及hCA XII抑制、CA非依赖机制或与其他分子靶点的相互作用。总体而言，强效酶抑制活性和观察到的细胞效应支持该化合物作为进一步研究的有前景骨架。未来使用侵袭性乳腺癌模型（包括常氧和缺氧条件下的MDA-MB-231细胞），并结合细胞hCA IX/hCA XII表达、活性及同工酶特异性靶点结合的直接测定，将有助于阐明其作用机制和转化潜力。