4-羟基香豆素-吡唑基吲哚-2-酮分子杂合体的重合成及其抗氧化与双重胆碱酯酶抑制抗阿尔茨海默病活性评价

《Chemistry & Biodiversity》：Design, Synthesis, and Biological Evaluation of Molecular Hybrids Incorporating Coumarin-Pyrazole-Linked Indolinone Derivatives With Antioxidant and Anti-Alzheimer Properties

　　

全球预期寿命的延长导致阿尔茨海默病（AD）发生率显著上升，使其成为重大公共卫生负担。因此，迫切需要建立有效方法以预防或延缓该疾病进展。为此，研究人员对15个既往报道的杂合分子（7a–c、10a–j和13a,b）进行重合成，这些分子结合4-羟基香豆素与吡唑基吲哚-2-酮结构，并检测其抗氧化和抗AD特性。其中若干化合物显示中等至强生物活性。在这些化合物中，化合物7a表现出优异的抗氧化能力（TAC = 80.65 mg gallic acid/g；IRP = 68.90 μg/mL）和显著的自由基清除能力（DPPH = 5.33 μg/mL；ABTS = 4.59 μg/mL；NO = 6.76 μg/mL），与标准抗氧化剂抗坏血酸相当。此外，化合物7a对乙酰胆碱酯酶（AChE）显示强抑制作用，IC₅₀为6.89 μg/mL，并对丁酰胆碱酯酶（BChE）显示强抑制作用（IC₅₀ = 5.93 μg/mL）。化合物7a的分子对接分析显示其在酶活性位点内具有有利的结合相互作用和稳定构象，支持其强抑制效应。总体而言，这些发现表明该组杂合分子为开发靶向胆碱酯酶的新型AD治疗药物提供了有前景的框架。

阿尔茨海默病（Alzheimer's disease，AD）是一种复杂神经退行性疾病，表现为进行性认知下降、记忆丧失和行为改变；其神经病理特征包括细胞外β-淀粉样蛋白（amyloid-beta，Aβ）斑块积聚、细胞内神经原纤维缠结、突触破坏及广泛神经元丢失。世界阿尔茨海默病报告显示，AD目前影响全球约4700万人，预计到2050年将增至近1.31亿人。由于AD发病机制复杂且多因素，单一症状性治疗难以满足需求；胆碱能假说仍被广泛接受，AChE和BChE在突触间隙水解乙酰胆碱，抑制二者可延长乙酰胆碱作用并改善认知功能，且AD脑中BChE活性增加，提示双重抑制可能具有更优治疗价值。现有donepezil、rivastigmine和galantamine虽可缓解症状，但过度胆碱能刺激相关不良反应限制其临床使用，且自2003年以来缺乏新获批AD治疗药物；同时，氧化应激和自由基对DNA、蛋白质及细胞膜的损伤参与AD相关病理。天然产物香豆素、isatin及pyrazole骨架均有抗AD或胆碱酯酶抑制报道，因此研究人员重合成整合4-羟基香豆素、pyrazolyl indolin-2-one的杂合分子，以期获得兼具抗氧化和抗AD活性的多靶点导向配体（multi-target directed ligand，MTDL）先导物。研究结论表明，化合物7a为最有效先导，该杂合骨架为开发靶向胆碱酯酶的AD治疗药物提供了有前景的框架。

关键技术方法：研究人员重合成15个目标杂合分子，并以¹H/¹³C NMR和HRMS进行结构表征；体外测定总抗氧化能力（TAC）和铁还原能力（IRP），以及DPPH、ABTS和NO自由基清除活性；采用Ellman比色法测定AChE和BChE抑制活性，以donepezil为标准；采用AutoDock Vina 1.5.7对hAChE（PDB ID：6O4W）和hBChE（PDB ID：4BDS）进行分子对接，并以Discovery Studio 2024可视化；用Desmond进行100 ns分子动力学（MD）模拟，分析RMSD、RMSF及蛋白–配体接触。研究未涉及临床样本队列。

2.1 Chemistry：研究人员按既往路线重合成7a–c、10a–j和13a,b；由4-羟基香豆素经3-乙酰基-4-羟基香豆素、Claisen–Schmidt缩合、吡唑啉环化及与5-硝基isatin或烷基化isatin缩合得到目标物，NMR和HRMS数据支持结构。2.2.1 In Vitro Antioxidant Activity：通过TAC和IRP测定，7a最高（80.65 ± 0.46 mg gallic acid/g；68.90 ± 0.46 μg/mL），13a次之（73.40 ± 0.46；61.65 ± 0.46），7b、7c约63–64和52，10a为41.34/29.59，其余10b–j和13b最低；抗坏血酸为93.00/81.25。原文将活性与─OH、─NH₂、─NO₂的供电子/共振稳定及溴的吸电子效应相联系。2.2.2 Scavenging Activity：通过DPPH、ABTS、NO清除实验，7a的IC₅₀分别为5.33、4.59、6.76 μg/mL，抑制率61.52%、65.27%、53.67%；13a为5.95、5.10、7.69 μg/mL；7b/7c约7.0、5.9、9.3 μg/mL；10a为12.40、9.93、19.54 μg/mL；其余较低；抗坏血酸为4.52、3.93、5.61 μg/mL。2.2.3 In Vitro Anti-Alzheimer's Activity：通过AChE/BChE抑制实验，7a最强（AChE 79.24%，IC₅₀ 6.89 μg/mL；BChE 61.81%，IC₅₀ 5.93 μg/mL），13a次之（70.90%，7.70；55.30%，6.63），7b/7c约60%和47%，10a为34.03%/26.54%，其余10b–j和13b最低；donepezil为93.44%/72.88%（IC₅₀ 5.84/5.03 μg/mL）。统计相关分析显示TAC、IRP、DPPH、ABTS、NO与AChE、BChE抑制呈显著正相关（p ≤ 0.01），支持其MTDL特征。3 Molecular Modeling：对接显示7a对hAChE结合亲和力?8.90 kcal/mol，与Phe295、Arg296、Ser293形成氢键，并与Tyr337、Asp74、Trp86、Trp286、Leu289产生疏水作用；donepezil为?8.37 kcal/mol、RMSD 0.18 ?。7a对hBChE为?7.79 kcal/mol，与Trp82、His438、Ala328、Tyr332疏水作用，与Ala328有卤键，与Tyr128、Asp70形成氢键；tacrine为?6.09 kcal/mol、RMSD 0.67 ?。3.1 Molecular Dynamics Simulations：100 ns MD显示hAChE–7a复合物总体稳定，70 ns前稳定，约75和85 ns出现小幅波动后稳定，80–100 ns残基80–100及250–350环区移动明显。3.1.1 Protein and Ligand RMSD and RMSF Analysis：基于RMSD/RMSF轨迹，蛋白–配体复合物保持稳定，配体在模拟时间内达平衡。3.1.2 Protein–Ligand Interactions Analysis：轨迹分析显示7a与Trp86（约25%）、Trp286（约40%）、His287（约40%）、Tyr341（约30%）有π作用，与Tyr124（约20%）、Trp286（约10%）、Leu289（约10%）、Asn283（约75%）、His287（约50%）、Tyr341（约30%）有极性/水桥氢键，并与Glu292、Ser293有离子作用。3.1.2.1 Histogram of Protein–Ligand Interactions Analysis：接触频率直方图和热图显示最多可同时形成10个接触，持久接触涉及Asn283、Trp286、His287、Glu292、Tyr341和Ser293。

讨论部分总结：原文将7a的优势归因于强吸电子硝基（─NO₂）有助于稳定自由基并增强抗氧化能力，活性位点氟相互作用可能通过限制底物进入和催化周转促进竞争性酶抑制；原文引述Younis et al.认为7a较高活性可能与其非芳香供体原子（N、O）数量较多有关，而溴取代降低活性；抗氧化、清除与胆碱酯酶抑制间的正相关支持MTDL特征。研究结论翻译：综上所述，研究人员重合成了三个既往报道的杂合化合物系列（7a–c、10a–j和13a,b），这些系列整合4-羟基香豆素与pyrazolyl indolin-2-one骨架，并评价其双重抗氧化和神经保护活性。体外生物学实验表明，若干衍生物可有效清除自由基并抑制AD发病机制中的关键酶，即AChE和BChE。在所有受试衍生物中，化合物7a始终为最有效先导。其优异生物活性归因于强吸电子硝基（─NO₂）基团，该基团有助于稳定自由基物种并增强抗氧化能力；此外，活性位点氟相互作用可能通过限制底物进入和催化周转而促进竞争性酶抑制。分子对接和100 ns MD模拟进一步证实7a在胆碱酯酶活性位点内具有优异结合亲和力和动态稳定性。总体而言，这些结果突出表明该杂合骨架是开发抗AD的MTDLs的有前景框架。