《The FASEB Journal》：Short-Term Unacylated Ghrelin Administration Improves Pyruvate Tolerance Without Chronically Altering Skeletal Muscle, Liver, or Adipose Tissue Insulin Response in Healthy Rats
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非酰化胃饥饿素（unacylated ghrelin，unAG）是一种具有代谢活性的激素，可急性刺激骨骼肌脂肪酸氧化（fatty acid oxidation，FAO），同时促进脂肪组织脂质生成并抑制脂解。基于这些急性效应，研究人员假设重复给予unAG可改善骨
非酰化胃饥饿素（unacylated ghrelin，unAG）是一种具有代谢活性的激素，可急性刺激骨骼肌脂肪酸氧化（fatty acid oxidation，FAO），同时促进脂肪组织脂质生成并抑制脂解。基于这些急性效应，研究人员假设重复给予unAG可改善骨骼肌胰岛素反应，且这一改善与肌肉脂质储存减少相关。研究人员对健康雄性Sprague–Dawley大鼠给予每日两次皮下注射unAG（200 μg；每日总剂量400 μg），持续5天。unAG处理在离体氧化型或糖酵解型骨骼肌中，于基础状态、低或高胰岛素浓度刺激下，或在肌肉预先暴露于高棕榈酸盐应激条件下，均未改变葡萄糖摄取或AKT激活。两种肌型中线粒体标志物（CPT1B、柠檬酸合酶、COXIV）的蛋白含量亦未随处理发生改变。值得注意的是，unAG处理动物对丙酮酸给药的血糖反应降低；然而，肝脏葡萄糖生成相关蛋白含量及肝脏对胰岛素的AKT反应均未改变。unAG处理倾向于增加内脏脂肪组织（visceral adipose tissue，VAT）中脂蛋白脂肪酶（lipoprotein lipase，LPL）蛋白含量（p = 0.07），但未改变皮下或内脏脂肪组织对胰岛素推注的AKT或激素敏感性脂肪酶（hormone-sensitive lipase，HSL）磷酸化反应。最后，红、白腓肠肌及肝脏中的甘油三酯（triacylglycerol，TAG）含量未因unAG给药而改变。总体而言，这些研究结果表明，短期unAG处理可改善丙酮酸耐受性，但不会对健康大鼠骨骼肌、肝脏或脂肪组织的底物代谢产生持续性代谢改变。
一、研究背景与目的
非酰化胃饥饿素（unacylated ghrelin，unAG）是循环中含量最丰富的胃饥饿素亚型，传统上被视为无生物活性的异构体，但近年研究已证实其在多种外周组织中具有代谢调节作用。既往研究显示，unAG可急性刺激骨骼肌脂肪酸氧化（fatty acid oxidation，FAO），同时在脂肪组织中促进脂质生成并抑制脂解。鉴于骨骼肌胰岛素抵抗与异位脂质蓄积密切相关，研究人员假设重复给予unAG可通过促进肌肉脂肪酸氧化并将循环脂质分流至脂肪组织储存，减少骨骼肌脂质蓄积，从而改善胰岛素反应。然而，关于慢性unAG处理对外周组织代谢影响的证据仍十分有限，且既往一项为期4天的unAG给药研究观察到骨骼肌胰岛素刺激的葡萄糖摄取增加，但其代谢评估在末次注射后仅3小时进行，无法排除急性效应的干扰。因此，本研究旨在系统评估短期重复unAG给药对健康瘦大鼠骨骼肌及全身胰岛素反应、肝脏和脂肪组织底物代谢的影响。
二、研究内容与主要结论
研究人员对健康雄性Sprague–Dawley大鼠给予每日两次皮下注射unAG（200 μg/次，每日400 μg）或对照溶媒，持续5天，并在末次注射约16小时后进行代谢评估，以避免急性效应干扰。研究发现：unAG处理未改变动物体重、摄食量或空腹血浆总胃饥饿素水平；未改变氧化型（比目鱼肌）或糖酵解型（趾长伸肌）骨骼肌在基础、低或高胰岛素条件下的葡萄糖摄取及AKT磷酸化；未保护骨骼肌免受急性高棕榈酸盐应激诱导的胰岛素刺激葡萄糖摄取损伤；未改变骨骼肌线粒体标志物蛋白含量（COXIV在趾长伸肌中反而显著降低）；未改变肝脏对胰岛素推注的AKT反应或肝脏葡萄糖生成相关蛋白（MCT1、PEPCK、G-6-Pase、GLUT2）含量；未改变皮下或内脏脂肪组织对胰岛素的AKT及HSL磷酸化反应，但倾向于增加内脏脂肪组织LPL蛋白含量（p = 0.0736）；未改变红、白腓肠肌及肝脏的甘油三酯（triacylglycerol，TAG）含量。值得注意的是，unAG处理显著降低了丙酮酸耐受性测试（pyruvate tolerance test，PTT）中血糖反应曲线下面积（area under the curve，AUC），提示糖异生反应降低。此外，骨骼肌及肝脏中推定unAG受体——促肾上腺皮质激素释放因子受体2（corticotropin-releasing factor receptor 2，CRF2R）蛋白含量未因处理而改变。
三、主要技术方法
本研究采用雄性Sprague–Dawley大鼠（约6周龄，150–175 g，购自Charles River Canada），适应性饲养10天后接受5天每日两次皮下注射unAG或磷酸盐缓冲液对照。主要技术方法包括：丙酮酸耐受性测试（腹腔注射2 g/kg丙酮酸，监测90分钟血糖）及胰岛素耐受性测试（1.5 U/kg腹腔注射）；离体骨骼肌孵育体系测定基础及胰岛素刺激的[3H]-2-脱氧葡萄糖摄取（采用放射性标记示踪法）；Western blot检测骨骼肌、肝脏及脂肪组织中AKT（Ser473/Thr308）、HSL（Ser563/Ser660/Ser565）磷酸化及CPT1B、柠檬酸合酶（citrate synthase，CS）、COXIV、MCT1、PEPCK、G-6-Pase、GLUT2、LPL、CRF2R等蛋白含量；比色法测定组织甘油三酯含量；ELISA测定血浆总胃饥饿素水平；比色法测定血浆游离脂肪酸（free fatty acid，FFA）浓度。
四、研究结果
3.1 总血浆胃饥饿素在unAG给药后30分钟升高：unAG处理组动物（n = 4）血浆总胃饥饿素浓度均超过检测上限（>18.2 ng/mL），呈超生理浓度；对照组（n = 3）为4.9 ± 0.39 ng/mL。
3.2 5天unAG给药不改变体重、摄食量或空腹血浆胃饥饿素水平：初始体重（p = 0.9913）、最终体重（p = 0.9395）及摄食量（p = 0.6206）均无组间差异；组织采集时（距末次注射约16小时）空腹血浆总胃饥饿素水平在对照组（2.684 ± 1.011 ng/mL）与unAG组（2.904 ± 0.7528 ng/mL）间无差异（p = 0.6167）。
3.3 unAG给药降低丙酮酸给药的糖异生反应：空腹血糖无组间差异（p = 0.9650）；胰岛素耐受性测试中胰岛素显著降低血糖（p < 0.0001）但无组间差异（p = 0.2131）；PTT中处理与时间存在显著交互效应（p = 0.0434），且unAG组血糖AUC显著降低（p = 0.0299）。
3.4 氧化型与糖酵解型骨骼肌胰岛素刺激的葡萄糖摄取和AKT激活不受5天unAG给药影响：比目鱼肌（p = 0.3717）和趾长伸肌（p = 0.4947）在基础、低胰岛素（0.5 mU/mL）或高胰岛素（10 mU/mL）条件下葡萄糖摄取均无组间差异；AKT在Ser473和Thr308位点的磷酸化在两种肌型中均无组间差异。
3.5 5天unAG给药不保护比目鱼肌免受急性高脂诱导的胰岛素刺激葡萄糖摄取损伤：4小时高棕榈酸盐（2 mM）预暴露降低低、高胰岛素条件下的葡萄糖摄取，但unAG处理未改善低（p = 0.1747）或高（p = 0.9348）胰岛素条件下的葡萄糖摄取反应。
3.6 5天unAG给药不改变氧化型或糖酵解型骨骼肌线粒体标志物蛋白含量：CS和CPT1B蛋白含量在两种肌型中均无组间差异；COXIV在比目鱼肌中无差异（p = 0.1742），但在unAG组趾长伸肌中显著降低（p = 0.0188）。
3.7 5天unAG给药不改变肝脏对胰岛素推注的AKT激活或肝脏葡萄糖生成相关蛋白含量：AKT在Ser473（p = 0.3958）和Thr308（p = 0.7698）的磷酸化无组间差异；MCT1（p = 0.4306）、PEPCK（p = 0.5728）、G-6-Pase（p = 0.9601）和GLUT2（p = 0.6304）蛋白含量均未改变。
3.8 皮下和内脏脂肪组织AKT及HSL磷酸化不受影响，但5天unAG注射倾向于增加LPL含量：SAT中LPL含量无差异（p = 0.9304），VAT中倾向于增加（p = 0.0736）；AKT磷酸化（Ser473和Thr308）在SAT和VAT中均无组间差异；HSL在Ser563、Ser660和Ser565位点的磷酸化及空腹血浆FFA水平（p = 0.3708）均无组间差异。
3.9 5天unAG给药不改变氧化型或糖酵解型骨骼肌或肝脏甘油三酯含量：白腓肠肌（p = 0.8463）、红腓肠肌（p = 0.9212）及肝脏（p = 0.2317）TAG含量均无组间差异。
3.10 5天unAG给药不改变骨骼肌或肝脏推定unAG受体CRF2R蛋白含量：比目鱼肌（p = 0.5907）、趾长伸肌（p = 0.4547）及肝脏（p = 0.8304）中CRF2R含量均无组间差异。
五、讨论与结论
本研究发现，与假设相反，短期重复unAG给药并未改善骨骼肌胰岛素反应或降低肌肉脂质含量。既往研究（4天每日两次200 μg unAG注射）观察到胰岛素刺激的葡萄糖摄取改善，但该研究在末次注射后3小时即进行评估，而本研究在约16小时后进行评估。研究人员既往已证实unAG刺激骨骼肌FAO的效应在激素暴露后可持续2–3小时，因此既往研究观察到的改善可能包含急性效应成分。本研究中丙酮酸耐受性的改善是新的发现，提示unAG可能降低肝脏糖异生反应，但肝脏AKT对胰岛素的反应及糖异生相关蛋白含量均未改变，提示可能存在转录水平以外的调节机制（如丙酮酸在肝脏内分配至氧化或糖原合成途径），或全身其他组织葡萄糖清除增加所致。脂肪组织中，unAG处理未改变AKT或HSL磷酸化反应，但VAT中LPL含量呈增加趋势（p = 0.0736），结合既往研究显示脂肪组织特异性LPL过表达可改善全身葡萄糖耐受性，这一趋势提示unAG可能通过促进餐后脂质向脂肪组织分流而发挥代谢保护作用，但该效应可能仅在代谢应激（如高脂饮食）条件下才更为显著。本研究存在仅使用雄性大鼠、肝脏及脂肪组织仅能评估胰岛素刺激状态、PTT结果不能确证糖异生改变等局限性。研究结论为：短期重复unAG给药可改善健康瘦大鼠的丙酮酸耐受性，但未引起骨骼肌胰岛素反应、肌肉或肝脏TAG蓄积、肝脏及脂肪组织胰岛素信号通路的慢性改变。在代谢健康表型中，unAG似乎不诱导慢性代谢变化，尽管其对周围组织代谢具有急性效应。未来研究应探讨在代谢应激条件（如慢性高脂喂养）下，重复unAG给药是否可通过其急性多组织效应改善骨骼肌胰岛素反应。
