水痘-带状疱疹病毒gE与gI双抗原mRNA疫苗共递送联合CpG-ODN佐剂激发强效免疫应答

《MedComm》：Co-Delivery of Varicella Zoster Virus gE and gI Dual-Antigen mRNA Vaccine With CpG-ODN Elicits Robust Immunity

带状疱疹（HZ）由潜伏水痘-带状疱疹病毒（VZV）再激活引起，仍是日益加重的健康负担。开发兼具高效力与改善耐受性的新型HZ疫苗，有助于克服现有疫苗的局限并提升接种率与全程接种完成率。为筛选最优抗原设计，研究人员系统评估了多种基于VZV糖蛋白E（gE）与糖蛋白I（gI）的mRNA候选疫苗。在小鼠中，膜定位的gE诱导了最强且最持久的抗体应答，而引入gI显著增强了T细胞应答。膜定位gE与gI的共递送（gE+gI Lmix）所激发的细胞免疫应答最为强效，优于单抗原疫苗与融合构建体。因此，研究人员选定gE+gI Lmix，并采用CpG寡脱氧核苷酸（CpG-ODN）佐剂进一步优化。在初免（na?ve）与VZV预免疫小鼠中，CpG-ODN 1018提高了中和抗体滴度，并显著增强了抗原特异性CD4⁺和CD8⁺ IFN-γ⁺ T细胞应答，呈现Th1偏向性特征。由此诱生的体液与细胞应答在小鼠中匹配或超过Shingrix疫苗所诱导的应答。安全性评估显示，CpG-ODN 1018给药后未见明显的全身毒性或组织病理学异常。综上所述，双抗原gE/gI mRNA疫苗接种——尤其是联合CpG-ODN 1018——是一种极具前景的HZ预防策略，兼具增强的细胞免疫原性与可接受的前期安全性特征。

带状疱疹（HZ）由水痘-带状疱疹病毒（VZV）再激活引起，约95%的成人存在VZV潜伏感染，约三分之一在其一生中会罹患HZ，且随着全球人口老龄化，HZ发病率持续上升，造成沉重的社会经济负担。目前广泛使用的两种疫苗各有局限：减毒活疫苗Zostavax对HZ的疫苗效力（VE）随年龄和接种后时间显著下降（首年约67%，10年后降至约15%），且其活病毒本质对免疫缺陷人群构成安全隐患；重组亚单位疫苗Shingrix对HZ及带状疱疹后神经痛（PHN）分别具有约74%和84%的保护效力并维持4年，但局部和全身不良反应发生率较高，17%的接种者经历3级不良反应，1.1%报告严重不良事件，耐受性不佳成为接种完成率低的重要原因（2023年美国≥50岁成人仅17%完成两剂接种，46%未接种者因顾虑副作用而拒绝接种），且其佐剂系统AS01B中的QS-21存在供应受限、安全性隐患及溶血活性等问题。由于细胞免疫（尤其VZV特异性CD4 T细胞）对预防HZ起关键作用，mRNA疫苗平台因能同时激发强效体液免疫并经内源性抗原呈递高效激活抗原特异性T细胞免疫而备受关注（Moderna的VZV mRNA候选疫苗mRNA-1468在I/II期临床试验中显示出良好前景）。

研究人员据此围绕两个目标开展研究：一是系统评估gE与gI不同组合与表达形式的mRNA疫苗免疫原性，筛选可诱导最优体液与细胞免疫的抗原构建体；二是评估Toll样受体9（TLR9）激动剂CpG寡脱氧核苷酸（CpG-ODN）对该优势候选疫苗的佐剂效应，以强化Th1偏向的细胞免疫。研究最终证实，膜定位gE与gI共递送（gE+gI Lmix）联合CpG-ODN 1018可在小鼠中诱导匹配或超过Shingrix的免疫应答，并具有可接受的前期安全性，为整合抗原优化与佐剂选择的下一代HZ疫苗理性设计提供了有前景的策略。该论文发表于《MedComm》。

主要技术方法包括：将编码不同抗原的mRNA经体外转录合成后，封装于脂质纳米颗粒（LNP）（采用与新冠疫苗BNT162b2相同的脂质组成）；通过酶联免疫吸附试验（ELISA）、斑点免疫酶联吸附试验（ELISPOT）、流式细胞术（含胞内细胞因子染色）及基于vOka毒株（北京万泰生物提供）与ARPE-19细胞的中和试验，系统评价体液与细胞免疫；样本为C57BL/6J小鼠（6-7周龄，每组5只，肌肉注射初免-加强免疫）；并通过皮下注射2000空斑形成单位（PFU）vOka毒株建立VZV预免疫小鼠模型，结合血清生化指标与心、肝、脾、肺、肾组织病理学检查评估安全性。

研究结果如下：

2.1 VZV mRNA疫苗的设计、制备与表征：研究人员构建了五种抗原设计——可溶性gEED、含Y569A替换的膜定位gE、经（GGGGS）₄柔性连接子连接的可溶性融合蛋白gEgIED与膜定位融合蛋白gEgITM，以及分别封装后混合的gE+gI Rmix与Lmix。所得mRNA-LNP封装效率约90%，平均粒径75.0至81.1 nm，多分散指数（PDI）低于0.3，Zeta电位近中性至弱负电，透射电镜（TEM）确认其呈规则球形，理化性质一致，为后续免疫原性研究奠定基础。

2.2 膜定位gE构建体诱导强效而持久的体液免疫：所有疫苗均诱导一致的gE及gEgI特异性IgG抗体，膜定位gE、gE+gI Rmix与gE+gI Lmix诱导最高滴度（约6-Log）及最高中和抗体（约4-Log），且gE特异性IgG至少维持17周（约5-Log），表明膜定位gE无论单用还是与gI共递送均优于可溶性构建体；而两种融合构建体较gEED仅带来适度改善。

2.3 糖蛋白I（gI）主要贡献于细胞免疫诱导：ELISPOT显示gE+gI肽池刺激诱导最强IFN-γ⁺与IL-2⁺应答，且gI贡献占比大于gE；gE+gI Rmix与Lmix诱导的应答显著高于各单抗原及融合疫苗，并诱导CD8⁺效应记忆T细胞（T_EM），提示共递送优于融合构建体可能因为独立表达更好地保留了天然类病毒抗原呈递。

2.4 CpG-ODN佐剂有效增强Th1偏向免疫：gE+gI Lmix联合CpG-ODN 1018诱导最高中和抗体滴度（显著超过Shingrix）；CpG-ODN显著提高IgG_2c/IgG₁比值（>1），且所有CpG-ODN佐剂疫苗比值均高于Shingrix；流式细胞术显示各佐剂组CD4⁺IFN-γ⁺与CD8⁺IFN-γ⁺频率显著升高，其中CpG-ODN 1018诱导最高CD4⁺IFN-γ⁺应答，仅CpG-ODN 1018显著提高CD4⁺IL-2⁺ T细胞频率。

2.5 联合CpG-ODN的双抗原mRNA疫苗具有可接受的前期安全性：gE+gI Lmix联合CpG-ODN 1018接种后小鼠体重1至2天短暂下降，7天内恢复至基线；血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）和肌酐（CREA）均在正常范围；心、肝、脾、肺、肾H&E染色未见明显组织损伤，所有候选疫苗均无明显全身毒性或组织病理学异常。

2.6 VZV预免疫小鼠模型中诱导强免疫应答：在vOka预免疫小鼠中，疫苗单剂即可诱导可检测的gE特异性IgG，加强后滴度显著升高；联合CpG-ODN 1018较无佐剂制剂显著提高CD4⁺IFN-γ⁺ T细胞频率，并适度增加CD8⁺IFN-γ⁺、CD4⁺IL-2⁺及CD8⁺IL-2⁺ T细胞频率，进一步支持CpG-ODN 1018作为HZ mRNA疫苗强效Th1偏向佐剂的潜力。

讨论部分：研究人员指出，膜锚定gE的Y569A替换将gE定位基序由AYRV改为AARV，使其从反式高尔基体网络（TGN）重定向至细胞表面，最大化质膜抗原密度，并保留天然构象（包括跨膜近端表位与糖基化模式），从而诱导更强更持久的抗体；gI对细胞免疫的贡献大于对体液免疫的贡献；gE与gI天然形成非共价异源二聚体，分别表达可使各自独立折叠并进行翻译后修饰，同时保留天然相互作用界面，从而拓宽免疫识别范围；mRNA平台经内源性抗原呈递（MHC I类途径）及抗原呈递细胞摄取加工（MHC II类途径）进一步增强免疫。CpG-ODN 1018与mRNA疫苗的协同作用可能源于二者先天免疫刺激的互补性，促进树突状细胞成熟与Th1分化；本研究CpG-ODN以与mRNA-LNP简单混合而非共封装的方式给药，为剂量优化提供了实用灵活的策略。作者同时承认多项局限：VZV严格的种属特异性导致缺乏可直接评估保护效力的小动物攻击模型，所测免疫指标为替代终点；实验仅使用年轻成年小鼠而非≥50岁目标人群，未反映免疫衰老影响；预免疫模型因商业疫苗供应受限未设Shingrix平行对照；细胞免疫观察期短于体液免疫；安全性评估仅限短期，未评估局部反应原性与长期安全性。

研究结论：本研究开发的gE+gI Lmix联合CpG-ODN 1018疫苗融合了三大疫苗学原则——mRNA平台的强效内源性抗原呈递、合理设计的双抗原策略以重现天然病毒免疫原性、以及协同性Th1佐剂放大并极化应答，其在小鼠中诱导的免疫应答匹配或超过获批疫苗Shingrix，并维持可接受的前期安全性，为开发具有更高潜在效力的新一代HZ疫苗奠定了坚实基础。