《Hippocampus》：Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF), Estrogen Receptors, and Mossy Cells
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中文摘要翻译：齿状回（DG）的功能依赖于脑源性神经营养因子（BDNF），该因子在主要细胞即颗粒细胞（GCs）中表现出强烈的合成。然而，BDNF蛋白存在于内分子层（IML），而该区域中大部分投射至颗粒细胞的传入纤维来自门区苔藓细胞（MCs）。因此，研究人员提出疑
中文摘要翻译：齿状回（DG）的功能依赖于脑源性神经营养因子（BDNF），该因子在主要细胞即颗粒细胞（GCs）中表现出强烈的合成。然而，BDNF蛋白存在于内分子层（IML），而该区域中大部分投射至颗粒细胞的传入纤维来自门区苔藓细胞（MCs）。因此，研究人员提出疑问：MCs是否表达BDNF mRNA和蛋白。通过使用成年小鼠，研究人员发现，大多数MC胞体及少数其他门区神经元中均表达MC BDNF mRNA和蛋白。有趣的是，与背侧DG相比，腹侧IML中的BDNF显著更高。此外，在雌性小鼠动情前期早晨（此时血清雌激素水平达到峰值），背侧IML的BDNF显著高于动情间期早晨（此时雌激素水平较低）。与这一观察一致的是，投射至背侧IML的腹侧MC胞体在动情前期早晨比动情间期早晨表现出更多的BDNF mRNA。接下来，研究人员探究动情前期早晨强烈的IML BDNF蛋白表达是否归因于雌激素在雌激素受体（ERs）上的作用，因为雌激素与ERs结合可增加BDNF合成。研究人员发现，MCs在两种性别中均高表达所有ERs：ERα、ERβ和GPER1。当两性数据合并时，被ERβ和GPER1标记的MC百分比超过了表达ERα的MC百分比。当仅检查动情前期雌性时，GPER1标记的MC数量多于ERα标记的MC。结果表明，MCs胞体具有强烈的BDNF表达，腹侧IML的BDNF相对较高，且具有动情周期依赖性。结果还突显了MCs中强烈的ER表达，尤其是ERβ和GPER1，使门区成为此前被低估的雌激素和BDNF作用位点。
论文解读文章
一、研究背景与科学问题
脑源性神经营养因子（Brain-Derived Neurotrophic Factor, BDNF）是神经营养因子家族的成员，主要与原肌球蛋白受体激酶B（Tropomyosin Receptor Kinase B, TrkB）结合，并以较低亲和力与p75神经营养因子受体（p75NTR）结合。在海马齿状回（Dentate Gyrus, DG）中，BDNF对主要细胞——谷氨酸能颗粒细胞（Granule Cells, GCs）的结构和功能具有多种重要作用。缺乏BDNF会对GC的树突棘、树突和轴突产生不利影响。BDNF对成年期新生GC的正常成熟也至关重要，这些细胞参与情绪调节及DG依赖的认知功能。
以往研究大多集中于GCs中BDNF的作用，因为BDNF mRNA和蛋白在GCs中高表达，且大部分BDNF被顺向转运至GC轴突即苔藓纤维（Mossy Fibers, MFs）。然而，与这些研究相比，关于DG中苔藓细胞（Mossy Cells, MCs）的BDNF蛋白表达知之甚少。MCs是门区（hilus）的主要细胞类型，是除GCs外唯一的谷氨酸能DG细胞类型，主要投射至GCs在内分子层（Inner Molecular Layer, IML）的近端树突。既往研究已显示IML中存在BDNF蛋白，提示MCs可能在其轴突中表达BDNF，但MC胞体的BDNF蛋白表达尚未被证实，可能是因为GCs的门区MF中BDNF蛋白水平过高，掩盖了MCs中BDNF的检测。转录组学研究显示MCs具有BDNF mRNA，但BDNF合成的程度及其在MC群体中的变异性尚未被研究。
由此引出几个关键问题：第一，MC胞体在多大程度上表达BDNF mRNA和蛋白？第二，MC BDNF是否沿隔颞轴（septotemporal axis）变化？第三，MC BDNF是否随性别和动情周期变化？鉴于GC BDNF蛋白在雌性大鼠中高于雄性，且大鼠中MF BDNF在动情周期中血清17β-雌二醇于动情前期早晨达到峰值后最高，雌激素波动可能影响BDNF。此外，MCs是否表达雌激素受体（Estrogen Receptors, ERs）尚不清楚。因此，研究人员开展了本研究。
二、研究内容与主要结论
研究人员在成年雄性和雌性小鼠中，通过免疫组织化学和原位杂交技术，系统检测了MC胞体及其IML轴突中BDNF mRNA和蛋白的表达情况，并比较了雄性、动情间期早晨（血清17β-雌二醇相对较低）和动情前期早晨（血清17β-雌二醇达到峰值）雌性之间的差异。同时，研究人员检测了MCs中ERα、ERβ和GPER1的表达，并通过c-Fos标记检测了MC的神经元活动。
研究得出以下主要结论：MCs在胞体中表现出强烈的BDNF mRNA和蛋白表达，且大多数MCs表达BDNF；腹侧IML的BDNF蛋白显著高于背侧IML；背侧IML的BDNF蛋白存在性别和动情周期依赖性变化，雄性和动情前期雌性显著高于动情间期雌性；腹侧MC胞体在动情前期早晨表现出强烈的BDNF mRNA标记；MCs中三种ERs（ERα、ERβ和GPER1）均有强烈表达，且当所有组数据合并时，表达GPER1和ERβ的MC百分比高于表达ERα的MC百分比。这些结果突显了MCs中强烈的ER和BDNF表达，表明门区是此前被低估的雌激素和BDNF作用位点。
三、关键技术方法
本研究采用的主要技术方法包括：1）免疫组织化学（Immunohistochemistry, IHC），使用经验证的小鼠单克隆抗BDNF抗体（Mab#9）检测BDNF蛋白，并使用GluR2/3抗体标记谷氨酸能神经元以识别MCs；2）原位杂交（In Situ Hybridization, ISH），使用RNAscope技术检测BDNF mRNA，并与MC标志物SATB1免疫荧光双标；3）双重免疫荧光标记，使用SATB1作为MC标志物，分别与ERα、ERβ和GPER1抗体进行双标；4）c-Fos与钙结合蛋白（calretinin）双标检测MC神经元活动；5）共聚焦显微镜成像和定量分析。研究样本来自C57BL6/SJL F1杂交背景的野生型（WT）小鼠，从Tg2576转基因小鼠群体中选育。
四、研究结果
4.1 MCs中的BDNF表达
研究人员首先通过抗BDNF和抗GluR2/3抗体双标检测MC胞体中的BDNF蛋白。结果显示，门区被BDNF蛋白所主导，高倍镜下可见部分细胞被双标，提示其为MCs。共聚焦z-stack确认部分门区细胞同时被抗BDNF和抗GluR2/3抗体标记。由于门区MF中BDNF强度过高，难以定量MC胞体的BDNF蛋白表达，研究人员改用原位杂交检测BDNF mRNA并与MC标志物SATB1双标。定量结果显示，大多数SATB1阳性门区神经元也表达BDNF mRNA，且表达BDNF mRNA的门区细胞中约100%同时表达SATB1。结果在雄性和动情间期或动情前期雌性之间无显著差异，表明大多数MCs在两种性别中均表达BDNF mRNA，且除MCs外，门区中很少有其他细胞表达BDNF mRNA。
4.2 MC轴突中BDNF蛋白及其沿隔颞轴的变化
研究人员检测了IML中的BDNF蛋白，发现免疫荧光和DAB明场染色均显示IML中BDNF蛋白表达强烈。通过将一侧半球冠状切取背侧切片、另一侧半球水平切取腹侧切片，研究人员比较了背侧和腹侧IML的BDNF蛋白。在雄性小鼠中，腹侧IML的BDNF蛋白显著高于背侧IML。雌性小鼠（动情间期和动情前期合并）也表现出相同的趋势，腹侧IML的BDNF免疫荧光显著高于背侧。这些数据提示，主要投射至腹侧IML的背侧MCs比腹侧MCs合成更多BDNF，或将其更多地转运至腹侧IML。
4.3 IML中MC轴突的BDNF蛋白随性别和动情周期阶段变化
研究人员比较了雄性、动情间期雌性和动情前期雌性的IML BDNF蛋白。结果显示，动情间期雌性背侧IML的BDNF显著低于雄性和动情前期雌性，而雄性和动情前期雌性之间无显著差异。这在小鼠中证实了大鼠中既往的发现，即MF BDNF在动情间期早晨弱于动情前期早晨。与背侧DG相反，腹侧IML的BDNF免疫荧光在雄性、动情间期雌性和动情前期雌性之间无显著差异。这些数据提示，主要投射至背侧IML的腹侧MCs（根据既往解剖学研究）响应性别和动情周期而改变BDNF蛋白，而主要投射至腹侧IML的背侧MCs则较少受性别和动情周期的影响。
4.4 BDNF mRNA显示与BDNF蛋白互补的隔颞和内分泌影响
为支持背侧IML BDNF在雄性和动情前期雌性中高于动情间期雌性是因为腹侧MC胞体中BDNF较高的解释，研究人员检测了腹侧MC的BDNF mRNA。同时表达BDNF mRNA和SATB1的细胞数量在雄性、动情间期和动情前期雌性之间，对于背侧或腹侧MCs均无显著差异。然而，部分腹侧MCs表现出非常强烈的BDNF mRNA标记。当仅对这些细胞进行定量时，雄性和动情前期雌性显著多于动情间期雌性。因此，表达BDNF mRNA的MC数量似乎没有差异，但雄性及动情前期雌性腹侧MCs中BDNF mRNA的量似乎高于动情间期雌性。
4.5 MCs中ERs的表达及其与BDNF蛋白表达的相关性
研究人员使用SATB1作为MC标志物，检测了MCs中ERα、ERβ和GPER1的表达。结果显示，ERs在表达SATB1的门区神经元中表达强烈。定量分析显示，高比例的SATB1阳性神经元也被ER抗体标记，且在雄性、动情间期雌性和动情前期雌性中比例均较高。当所有三组数据合并时，被GPER1和ERβ标记的MC数量多于被ERα标记的MC数量。当分别检查三组时，动情前期雌性中GPER1标记的MC数量多于ERα标记的MC数量。这些数据表明，MCs在两种性别中均强烈表达ERs，且当所有组数据合并时，表达GPER1和ERβ的MC百分比高于表达ERα的MC百分比。
4.6 检测MC BDNF的活动依赖性
为检验动情周期依赖性BDNF蛋白是否因动情前期早晨17β-雌二醇升高增加MC活动，从而导致活动依赖性BDNF合成，研究人员使用c-Fos抗体和MC标志物calretinin对动情前期和动情间期雌性进行双标。结果显示，动情间期和动情前期雌性之间，表达c-Fos的MC数量无显著差异。GC的c-Fos在两组之间也无显著差异。这些数据不支持动情前期雌性MC BDNF高于动情间期雌性是因为动情前期早晨MC活动较高的假设。
五、讨论与结论
研究结果表明，成年小鼠MCs在胞体中表现出强烈的BDNF mRNA和蛋白表达，且IML中存在强烈的BDNF蛋白表达。大多数MCs表达BDNF mRNA和蛋白，而其他门区神经元表达的BDNF mRNA少得多。腹侧IML的BDNF蛋白高于背侧IML。背侧IML的BDNF蛋白存在性别和动情周期依赖性变化，雄性和动情前期雌性高于动情间期雌性。腹侧MC胞体在动情前期早晨表现出强烈的BDNF mRNA标记。由于腹侧MCs主要投射至背侧IML，数据提示腹侧MC胞体中较高的BDNF mRNA可能解释了背侧IML中较高的BDNF。
动情前期早晨与动情间期早晨的一个区别是，动情前期早晨是动情周期中血清17β-雌二醇水平达到峰值的时期，而动情间期早晨血清17β-雌二醇水平相对较低。因此，较高的血清17β-雌二醇水平可能通过结合MC ERs刺激MC BDNF合成。研究人员发现大多数MCs中三种ERs均有强烈表达。此外，动情前期和动情间期早晨之间MCs的c-Fos表达无显著差异，提示活动依赖性BDNF合成不能解释动情前期早晨MC BDNF相对较高。
既往研究已提示MC轴突表达BDNF，因为IML被证明通过免疫组织化学显示BDNF蛋白。虽然MCs的BDNF顺向转运尚未被证明，但GCs中该转运过程强烈，因此有先例。然而，其他表达BDNF的神经元也投射至IML，如乳头上核（supramammillary nucleus）的神经元，尽管其BDNF表达较弱，仍可能是IML BDNF的来源。因此，使用MC标志物证明大多数MC胞体表达BDNF具有重要意义。该方法的局限性在于mRNA并不总能转化为蛋白。
雄性和雌性均表现出腹侧DG的IML中BDNF蛋白表达显著高于背侧DG。可能的原因是MC轴突的解剖特征：背侧MCs主要投射至同侧腹侧IML而非局部。因此，结果提示背侧MCs平均合成比腹侧MCs更多的BDNF蛋白，或背侧MCs将其更多地转运至轴突。例外的是表现出强烈BDNF mRNA表达的MC亚群，主要位于腹侧DG，且主要在动情前期雌性中，可能贡献了动情前期早晨背侧IML较高的BDNF。
隔颞轴MC BDNF变化的意义与背侧DG更涉及空间记忆和认知功能、腹侧DG更涉及情境记忆和情绪或边缘功能的观点相关。既往研究也表明，背侧和腹侧MCs在基因表达、电生理特性、行为效应、IML投射宽度以及对癫痫动物模型的脆弱性方面存在差异。这些差异可能共同促成背侧和腹侧DG功能的差异。
综上所述，本研究证明了MCs中强烈的BDNF胞体表达、腹侧IML相对较高的BDNF表达以及动情周期依赖性。结果还突显了MCs中强烈的ER表达，尤其是ERβ和GPER1，表明门区是此前被低估的雌激素和BDNF作用位点。BDNF在DG中的作用及其调控远比仅由GCs介导的更为复杂。
