基于UHPLC-DAD-HRMS2的具抗病毒活性毛萼芒索藤提取物中新型二氢查尔酮缀合物的表征：诊断性裂解途径与寡聚多酚的去重复化鉴定

《JOURNAL OF MASS SPECTROMETRY》：UHPLC-DAD-HRMS2 Characterization of Novel Dihydrochalcone Conjugates From the Antiviral Mansoa hirsuta Extracts: Diagnostic Fragmentation Pathways and Dereplication of Oligomeric Polyphenols

　　

摘要专业翻译 高分辨质谱（HRMS）联用超高效液相色谱（UHPLC）能够实现对药用植物中复杂多酚类成分的快速表征。毛萼芒索藤（Mansoa hirsuta，紫葳科Bignoniaceae）是一种传统上用于治疗感染性疾病的新热带藤本植物，但其化学成分尚未被充分研究。本研究报道了该植物叶、茎和果实乙醇提取物的全面UHPLC–DAD–HRMS/MS分析，共鉴定出57种酚类化合物，其中包含40种此前未报道的黄酮缀合物。精确质量测定与诊断性MS/MS裂解模式使研究人员得以完成五类二氢查尔酮衍生代谢物的结构表征：二氢查尔酮-酪胺缀合物、二氢查尔酮-黄烷酮（mansoin型）缀合物、二氢查尔酮-黄烷-3-醇缀合物及二氢查尔酮-黄酮醇缀合物。特征性碎片离子，尤其是对应于二氢查尔酮核心和酪胺部分的碎片离子，为新型寡聚黄酮的注释提供了支持。器官特异性代谢物分布揭示：叶片富含Mansoin A型异三聚体，茎中含苯乙醇苷和肉桂酰基芒果苷，果实则以较简单的二氢查尔酮-酪胺缀合物为主。所有提取物均表现出低细胞毒性（CC50 > 400 μg·mL?1）和选择性抗病毒活性，其作用对象包括寨卡病毒（ZIKV）、基孔肯雅病毒（CHIKV）、马亚罗病毒（MAYV）和登革病毒血清型2（DENV-2）。茎提取物对ZIKV表现出最高的选择性（SI > 25.5），而果实提取物对DENV-2表现出最强的效力（EC50 = 25.4 ± 1.2 μg·mL?1；SI > 19.7）。这些发现拓展了对毛萼芒索藤的植物化学认知，证明了基于HRMS的代谢物分析在复杂黄酮去重复化中的实用性，并为其他植物物种中相关寡聚黄酮的表征提供了可应用的诊断性MS/MS裂解模式。

论文解读

一、研究背景与目的

天然产物是抗病毒药物发现的重要来源，其中黄酮类和苯乙醇苷类等植物次生代谢产物已被证实可通过多种机制抑制RNA病毒。毛萼芒索藤（Mansoa hirsuta D.C.）属于紫葳科（Bignoniaceae），是一种分布于南美洲巴西塞拉多、卡廷加和大西洋森林等生物群落的新热带藤本植物，民间俗称“cipó-de-alho”，传统上用于治疗感染性疾病、炎症性疾病和胃肠道疾病。尽管具有重要的民族药理学价值，该物种的化学成分此前仅被部分探索，已有研究从其分离出六种结构复杂的不对称异三聚体黄酮——mansoin A–F。然而，其不同器官（叶、茎、果实）的全面植物化学表征仍属空白，且其抗病毒潜力尚未得到系统评估。登革病毒（DENV）、寨卡病毒（ZIKV）、马亚罗病毒（MAYV）和基孔肯雅病毒（CHIKV）在热带和亚热带地区造成重大公共卫生负担，且治疗选择有限。因此，本研究旨在：（i）利用UHPLC联用DAD和高分辨串联质谱对毛萼芒索藤叶、茎、果实乙醇提取物进行全面化学成分表征；（ii）评估这些提取物对DENV、ZIKV、MAYV和CHIKV的抗病毒效果。

二、研究内容与主要结论

研究人员对毛萼芒索藤的叶、茎和果实分别进行室温乙醇渗漉提取，利用UHPLC–DAD–HRMS/MS技术对三种提取物进行了系统的植物化学分析，共推定鉴定出57种酚类化合物，其中40种为此前未报道的黄酮缀合物。所有提取物均表现出低细胞毒性（CC₅₀ > 400 μg·mL^?1），并具有选择性抗病毒活性。茎提取物对ZIKV表现出最强选择性（EC₅₀ = 15.7 ± 1.9 μg·mL^?1，SI > 25.5），果实提取物对DENV-2效力最高（EC₅₀ = 25.4 ± 1.2 μg·mL^?1，SI > 19.7），叶片提取物则表现出广谱抗病毒活性。这些发现显著拓展了对毛萼芒索藤的植物化学认知，证明了HRMS代谢物分析在复杂黄酮去重复化中的实用价值，并为相关寡聚黄酮的结构表征提供了可推广的诊断性裂解模式。

三、关键技术与方法

本研究采用的核心技术方法包括：超高效液相色谱联用二极管阵列检测器和高分辨四极杆飞行时间串联质谱（UHPLC–DAD–ESI-QTOF-MS/MS），在正离子模式下进行数据依赖性二级质谱采集，碰撞能量范围为15–60 eV；基于精确质量测定（误差≤5 ppm）、同位素模式分析、保留时间、UV吸收特征及与文献MS/MS裂解数据比对进行分子式归属和化合物推定鉴定；利用MTT比色法评估提取物在Vero、LLC-MK2和MRC-5细胞系中的细胞毒性（CC₅₀），并通过细胞病变效应抑制试验测定抗病毒半数有效浓度（EC₅₀）和选择性指数（SI）。植物材料采集自巴西米纳斯吉拉斯州Caratinga生物站，凭证标本（BHCB 23862）存放于BHCB/UFMG标本馆。

四、研究结果

3.1 植物化学总览：在叶、茎、果实乙醇提取物中全面表征了57种酚类化合物，依据中心黄酮骨架将其分为五类结构群：二氢查尔酮-酪胺缀合物、二氢查尔酮-黄烷酮缀合物（Mansoin型）、二氢查尔酮-黄烷-3-醇缀合物、二氢查尔酮-黄酮缀合物和二氢查尔酮-黄酮醇缀合物。所有缀合物的特征性基峰碎片离子为m/z 243.1018 [M+H]⁺，对应2′,4′,4-三羟基二氢查尔酮残基。器官间代谢物分布差异显著：叶片富含Mansoin A型异三聚体（化合物41占41.84%，化合物49占48.42%）及二氢查尔酮-黄酮和黄酮醇缀合物；茎中主要含苯乙醇苷类（毛蕊花苷13.9%、异毛蕊花苷4.07%）和肉桂酰基芒果苷衍生物；果实则富含二氢查尔酮-酪胺缀合物（化合物9占20.48%，化合物11占32.54%）和Mansoin C型化合物。

3.2 含二氢查尔酮和酪胺结构单元的黄酮缀合物的表征：共推定鉴定出11种含酪胺残基的含氮酚类缀合物，其特征为137 Da（C₈H₁₁NO）中性丢失。化合物3（m/z 380.1861 [M+H]⁺）为该系列最简单成员，仅在果实中检出。化合物7–8（C₂₉H₃₅NO₈）和9–12（C₂₉H₃₅NO₉）为糖基化衍生物，后者多一个氧原子（16 Da），提示糖残基上的羟基化。化合物33–34（C₅₀H₆₀NO₁₇）为推定三聚体结构，含两个二氢查尔酮单元、一个酪胺残基和多个糖基取代基，仅在果实中检出。化合物36–37（C₅₁H₅₇NO₂₀）为含二氢查尔酮、黄烷酮和酪胺结构单元的复杂杂合体，其裂解谱中327和297碎片离子提示黄烷酮单元的存在。

3.3 含二氢查尔酮和黄烷酮结构单元的黄酮缀合物的表征：共19种化合物属于此类，包括已报道的mansoin A–F及13种新型类似物。该类缀合物的诊断性裂解特征为基峰m/z 243.1018 [M+H]⁺及162 Da（己糖）连续中性丢失。化合物19（m/z 677.2237 [M+H]⁺）和21（m/z 693.2180 [M+H]⁺）为单糖基化二聚体；化合物22（m/z 839.2773 [M+H]⁺）为二糖基化衍生物；化合物28–29（m/z 855.2720 [M+H]⁺）为含儿茶酚C环的Mansoin C型异构体；化合物39–42（m/z 1097.3680 [M+H]⁺）为Mansoin B型异构体；化合物47–51（m/z 1259.4157 [M+H]⁺）为Mansoin A型及其异构体，其中化合物49在叶片中含量最高（48.42%）；化合物54–55（m/z 1339.4651 [M+H]⁺）含额外二氢查尔酮残基；化合物56–57（m/z 1421.4750 [M+H]⁺）较Mansoin A多一个己糖残基。

3.4 含二氢查尔酮和黄烷-3-醇结构单元的黄酮缀合物的表征：化合物20（m/z 679.2387 [M+H]⁺，C₃₆H₃₈O₁₃）和23（m/z 841.2929 [M+H]⁺，C₄₂H₄₈O₁₈）为新型杂二聚体，其特征为饱和C环（黄烷-3-醇单元）。化合物23为化合物20的二糖基化类似物，两者均在叶片中检出。碎片离子m/z 301.1070对应（表）儿茶素或立体异构体，通过醌甲基化物（QM）裂解产生。

3.5 含二氢查尔酮和黄酮结构单元的黄酮缀合物的表征：共10种化合物含中心黄酮单元（C环C₂=C₃不饱和），其特征为UV Band I吸收在273–280 nm。化合物24–27（m/z 853.2562 [M+H]⁺，C₄₂H₄₄O₁₉）为二糖基化二聚体，其诊断性碎片m/z 419.1124和313.0707来自黄酮单元的RDA裂解。化合物35（m/z 999.2938 [M+H]⁺）含咖啡酸残基（308 Da中性丢失）。化合物38（m/z 1067.3681 [M+H]⁺）仅在叶片中检出，推定含三个二氢查尔酮残基和一个黄酮单元。化合物43–46（m/z 1257.4069 [M+H]⁺，C₆₃H₆₈O₂₇）为高相对分子质量寡聚体，具有连续162 Da丢失的裂解特征。

3.6 含二氢查尔酮和黄酮醇结构单元的黄酮缀合物的表征：化合物30–31（m/z 869.2508 [M+H]⁺，C₄₂H₄₄O₂₀）为含3-羟基黄酮（黄酮醇）单元的二糖基化二聚体，较黄酮类似物多16 Da（一个氧原子）。其诊断性碎片m/z 435.1070和329.0655区别于黄酮类。化合物52–53（m/z 1273.4019 [M+H]⁺，C₆₃H₆₈O₂₈）为更高相对分子质量的类似物，含三个己糖残基，仅在叶片中检出。

3.7 其他多酚类化合物的鉴定：共鉴定出12种附加多酚，包括简单黄酮、酰化氧杂蒽酮C-糖苷和苯乙醇苷。化合物1（2′,4′,4-三羟基二氢查尔酮）和2（圣草酚）为复杂缀合物的关键生物合成前体，仅在果实中检出。化合物4–6为黄酮O-糖苷（芹菜素-O-葡萄糖醛酸苷、山柰酚-O-葡萄糖苷、6-羟基木犀草素-O-葡萄糖苷），仅在叶片中检出。化合物13–16为四种芒果苷C-糖苷衍生物（muraxanthone、2′-O-反式肉桂酰芒果苷、2′-O-反式香豆酰芒果苷、2′-O-反式咖啡酰芒果苷），仅在茎中检出。化合物17–18为毛蕊花苷和异毛蕊花苷，仅在茎中检出。

3.8 抗病毒试验：所有提取物在LLC-MK2和Vero细胞中均显示低细胞毒性（CC₅₀ > 400–500 μg·mL^?1）。茎提取物对ZIKV具有强效选择性抗病毒活性（EC₅₀ = 15.7 ± 1.9 μg·mL^?1，SI > 25.5），显著超过有前景阈值（SI ≥ 10），优于阳性对照利巴韦林（EC₅₀ = 94.47 μg·mL^?1，SI = 3.9）。叶提取物表现出广谱活性，对ZIKV（SI = 10.3）、CHIKV（SI = 4.2）和MAYV（SI = 4.1）均具抑制效果。果实提取物对DENV-2效力最高（EC₅₀ = 25.4 ± 1.2 μg·mL^?1，SI > 19.7），并对ZIKV（SI > 14.1）和MAYV（SI > 9.5）也具显著活性。

五、讨论与结论

本研究表明，毛萼芒索藤不同器官的乙醇提取物具有显著差异的化学成分分布，反映了组织特异性生物合成途径。二氢查尔酮-酪胺缀合物的结构多样性提示其生物合成涉及酪氨酸脱羧酶来源的酪胺与辅酶A活化的二氢查尔酮单元的结合，随后经糖基转移酶和氧化偶联反应形成寡聚体。果实作为复杂含酪胺缀合物的主要积累部位，而叶片是复杂寡聚黄酮生物合成的主要场所，茎则富含苯乙醇苷和酰化芒果苷。高选择性指数，特别是茎提取物对ZIKV（SI > 25.5）和果实提取物对DENV（SI > 19.7），支持进一步开展生物活性导向分离和构效关系研究。这些发现为开发针对ZIKV和DENV等虫媒病毒的新型天然抗病毒候选药物提供了重要基础，同时建立的诊断性MS/MS裂解模式可推广应用于其他植物物种中相关寡聚黄酮的表征与去重复化鉴定。