《Journal of Biochemical and Molecular Toxicology》：Protective Role of miR-432-5p Against Propofol-Induced Neurotoxicity Through Regulation of ITK in SH-SY5Y Cells
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丙泊酚（propofol）在小儿麻醉中的广泛使用，使其潜在的神经发育毒性及儿童长期认知损害受到显著关注。为探讨miR-432-5p对丙泊酚诱导神经毒性的保护作用，并阐明其通过靶向白细胞介素-2诱导型T细胞激酶（interleukin-2-inducible T
丙泊酚（propofol）在小儿麻醉中的广泛使用，使其潜在的神经发育毒性及儿童长期认知损害受到显著关注。为探讨miR-432-5p对丙泊酚诱导神经毒性的保护作用，并阐明其通过靶向白细胞介素-2诱导型T细胞激酶（interleukin-2-inducible T-cell kinase，ITK）介导的潜在机制，研究人员采用SH-SY5Y细胞系构建丙泊酚诱导损伤的体外模型。随后定量检测细胞存活、凋亡百分比及促炎因子[肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）和白细胞介素-6（IL-6）]分泌。最后，通过双荧光素酶报告基因实验（dual-luciferase reporter assay）验证miR-432-5p与其靶点ITK之间的直接相互作用。丙泊酚暴露后miR-432-5p显著下调。在体外，miR-432-5p过表达改善细胞活力、降低凋亡并抑制促炎细胞因子释放。ITK被验证为miR-432-5p的直接下游靶点。此外，ITK的补偿性过表达部分逆转了miR-432-5p诱导的抗凋亡和抗炎保护表型。miR-432-5p/ITK调控轴通过抑制凋亡和神经炎症显著减轻丙泊酚诱导的细胞损伤。维持miR-432-5p丰度为预防麻醉相关认知损害提供了有希望的理论基础和治疗靶点。
丙泊酚（propofol）因起效快、恢复平稳而广泛用于小儿麻醉，但发育期脑暴露可导致远期学习、记忆和认知损害，甚至潜在不可逆的神经认知缺陷。其神经毒性主要与凋亡通路过度激活、严重氧化应激及促炎细胞因子大量释放有关，因此识别可减轻该损伤级联的靶点，对优化小儿麻醉策略和保障长期手术安全具有重要意义。miRNA通过转录后调控维持神经系统稳态，全麻药可扰乱该平衡，靶向特定miRNA可减轻丙泊酚诱导的神经毒性和凋亡。既往研究提示，在丙泊酚诱导的发育性海马损伤中存在多个miRNA-mRNA调控网络失调，生物信息学分析显示miR-432-5p显著下调，而其预测靶基因ITK异常升高；ITK是驱动炎症介质释放和细胞凋亡的关键激酶，与中枢神经系统严重炎症及丙泊酚神经毒性相关。然而，miR-432-5p在丙泊酚诱导神经毒性和炎症微环境调控中的具体作用尚未明确，其与ITK的靶向调控关系也需验证。为此，研究人员建立体外丙泊酚损伤模型，评估miR-432-5p/ITK轴对细胞凋亡和神经炎症的调控作用，旨在阐明该靶向网络的保护机制，并为预防麻醉相关认知损害提供治疗靶点。研究发现，miR-432-5p过表达可提高受损细胞活力、减少凋亡并抑制TNF-α、IL-1β和IL-6释放；ITK为miR-432-5p直接下游靶点；ITK过表达可部分逆转miR-432-5p的保护作用。研究结论提示，miR-432-5p/ITK轴可减轻丙泊酚诱导的细胞损伤，具有作为麻醉相关神经毒性治疗靶点的潜在价值。
关键技术方法：研究使用SH-SY5Y人神经母细胞瘤细胞系（ATCC，2024年获得，RRID：CVCL_0019；样本来源为ATCC细胞系），以1～20 μg/mL丙泊酚处理6、12、24、48 h进行筛选，确定10 μg/mL、24 h为建模条件；转染miR-432-5p mimic/miR-NC及ITK过表达质粒（OE-ITK）/对照（OE-NC）。采用细胞计数试剂盒-8（CCK-8）检测细胞活力，流式细胞术Annexin V-FITC/PI检测凋亡，酶联免疫吸附试验（ELISA）检测TNF-α、IL-1β、IL-6，逆转录定量实时PCR（RT-qPCR）与蛋白免疫印迹（Western blotting）检测表达，双荧光素酶报告基因实验验证靶向关系。
研究结果如下。3.1 体外实验证实miR-432-5p改善受损SH-SY5Y细胞活力并抑制炎症：通过浓度和时间梯度实验，丙泊酚呈剂量和时间依赖性降低细胞活力和miR-432-5p表达，确定10 μg/mL、24 h为最佳建模条件；转染miR-432-5p mimic确认过表达效率后，CCK-8和流式细胞术显示miR-432-5p过表达显著改善丙泊酚所致细胞活力下降并降低凋亡率；ELISA显示其显著抑制TNF-α、IL-1β和IL-6异常升高。3.2 ITK是miR-432-5p直接下游靶基因：TargetScan预测ITK的3′UTR含高度保守的miR-432-5p潜在结合位点；双荧光素酶报告基因实验显示miR-432-5p mimic显著降低ITK-WT荧光活性，而对ITK-MUT无显著影响；RT-qPCR和Western blotting显示丙泊酚升高ITK mRNA和蛋白水平，miR-432-5p过表达可逆转该上调，表明ITK在转录后阶段受miR-432-5p直接靶向负调控。3.3 ITK过表达部分抵消miR-432-5p的神经保护和抗炎作用：功能挽救实验显示，共转染OE-ITK显著减弱miR-432-5p mimic对ITK表达的抑制，恢复其mRNA和蛋白水平；同时削弱miR-432-5p对受损细胞活力的维持作用，使凋亡率重新显著升高，并导致TNF-α、IL-1β和IL-6水平显著反弹，说明miR-432-5p主要通过靶向抑制ITK过表达减轻丙泊酚诱导的细胞损伤和炎症反应。
讨论部分指出，丙泊酚在小儿手术中的广泛应用使其潜在神经毒性受到关注，阐明机制对神经保护策略至关重要。作者称首次报告丙泊酚暴露显著降低细胞miR-432-5p表达，外源补充可通过特异性靶向抑制ITK抑制神经炎症并阻断凋亡。凋亡和严重神经炎症是麻醉神经毒性的核心病理驱动；本模型见促炎因子大量分泌、细胞活力受损和凋亡率显著增加，而miR-432-5p过表达可有效抑制细胞因子释放并降低凋亡率。miRNA主要通过与靶转录本3′UTR特异结合实现转录后调控；双荧光素酶报告基因实验和挽救实验证明ITK是该轴的关键直接靶点，ITK表达水平与细胞应激和炎症反应增强具有明确功能关联。原文未直接研究NF-κB（nuclear factor kappa-B，核因子κB）或MAPK（mitogen-activated protein kinase，丝裂原活化蛋白激酶）级联，但作者指出ITK作为非受体酪氨酸激酶与上述炎症通路联系已较明确，并据此提出miR-432-5p可能通过沉默ITK切断炎症放大环路。作者还讨论了miRNA多靶点网络及与其他miRNA保护轴的差异，认为本轴靶向免疫炎症上游激酶，作用于病理级联较高层级。局限包括仅使用单一永生化SH-SY5Y细胞系，不能直接推广至体内神经发育过程；后续需原代神经元、脑类器官或动物研究验证；miR-432-5p是否通过其他关键因子协同发挥保护作用仍需高通量筛选；ITK介导的NF-κB或MAPK下游信号机制尚未详细阐明。研究结论翻译：总之，研究结果表明miR-432-5p通过靶向ITK减轻丙泊酚诱导的凋亡和神经炎症；这一新的miR-432-5p/ITK轴可能减轻丙泊酚诱导的细胞损伤，提示其可能作为对抗麻醉相关神经毒性的治疗靶点。
