《Journal of Biochemical and Molecular Toxicology》：Leuprorelin Suppresses Angiogenesis and Malignant Progression in Endometrial Cancer via Downregulation of the ELAVL1/VEGFA Axis
编辑推荐：
亮丙瑞林（Leuprorelin）是一种促性腺激素释放激素（gonadotropin-releasing hormone，GnRH）激动剂，目前临床用于通过垂体脱敏作用抑制雌激素依赖性子宫内膜癌（endometrial cancer，EC）。然而，该药物是否通
亮丙瑞林（Leuprorelin）是一种促性腺激素释放激素（gonadotropin-releasing hormone，GnRH）激动剂，目前临床用于通过垂体脱敏作用抑制雌激素依赖性子宫内膜癌（endometrial cancer，EC）。然而，该药物是否通过转录后调控机制发挥直接的抗肿瘤作用尚不清楚。研究人员在EC细胞系中利用集落形成、5-乙炔基-2′-脱氧尿苷（5-ethynyl?2’-deoxyuridine，EdU）掺入、Transwell迁移、伤口愈合、流式细胞术及人脐静脉内皮细胞（HUVEC）管形成实验评估了亮丙瑞林的表型效应。机制探索采用RNA免疫沉淀（RNA immunoprecipitation，RIP）、mRNA衰减动力学分析以及RNA荧光原位杂交联合免疫荧光显微镜技术。体内验证研究采用小鼠异种移植瘤模型系统。亮丙瑞林处理显著降低EC细胞的增殖和迁移能力，诱导细胞凋亡，并抑制HUVEC管形成。在分子水平上，亮丙瑞林给药减少了ELAVL1（一种RNA结合蛋白，生理状态下与VEGFA转录本结合并增强其稳定性）的胞质蓄积。这一减少导致VEGFA mRNA加速降解，进而下调VEGFA蛋白表达。强制过表达VEGFA可显著消除亮丙瑞林介导的抗肿瘤效应。在裸鼠异种移植瘤模型中，亮丙瑞林给药抑制了肿瘤生长及肿瘤相关新生血管形成，而VEGFA过表达可逆转这些效应。亮丙瑞林通过破坏ELAVL1介导的VEGFA mRNA稳定性来阻碍EC进展，提示ELAVL1/VEGFA轴可作为抗血管生成治疗干预的潜在靶点。
子宫内膜癌是全球最常见的三大妇科恶性肿瘤之一，近年来发病率持续上升，主要影响围绝经期和绝经后女性。尽管早期诊断通常预后良好，但晚期或复发患者的5年生存率不足20%。长期无拮抗的雌激素暴露是子宫内膜癌发生的主要驱动因素。虽然手术切除是治疗基石，常联合放疗、全身化疗或激素干预，但耐药仍是重大临床挑战。近年来，基因组分析和分子靶向策略日益受到重视，因此解析调控子宫内膜癌治疗反应的分子网络对制定合理治疗方案至关重要。
亮丙瑞林作为促性腺激素释放激素激动剂，通过脱敏垂体促性腺激素分泌来抑制雌激素生物合成，临床广泛用于晚期前列腺癌、子宫内膜异位症和中枢性性早熟等激素依赖性疾病。新近证据提示亮丙瑞林可能在外周组织具有直接抗肿瘤特性，但介导其在子宫内膜癌病理生理中作用的具体分子通路仍不完全清楚。ELAVL1（又称HuR）是一种RNA结合蛋白，通过结合mRNA 3′-非翻译区的AU富集元件来稳定mRNA，在多种癌症中过表达。既往研究已证实ELAVL1参与GnRH受体激活介导的基因调控，提示其可能是亮丙瑞林非激素抗肿瘤效应的关键下游分子。因此，本研究旨在验证亮丙瑞林对子宫内膜癌细胞的抑制作用，并探讨这些效应是否通过调控ELAVL1介导。
研究人员首先通过CCK-8实验评估亮丙瑞林（0.5–8 μM）对HESC和HEC-1A细胞活力的影响，确定2 μM为后续表型实验的工作浓度。随后采用集落形成实验、EdU掺入实验、Transwell迁移实验、伤口愈合实验和流式细胞术评估亮丙瑞林对HEC-1A细胞恶性表型的影响。在机制层面，研究人员利用TCGA-UCEC数据分析ELAVL1在子宫内膜癌组织中的差异表达及其与VEGFA的相关性，通过RT-qPCR和Western blot检测亮丙瑞林处理后ELAVL1和VEGFA的表达变化，并采用HUVEC管形成实验评估血管生成能力。为阐明ELAVL1调控VEGFA的机制，研究人员在EC细胞系中进行了ELAVL1敲低和过表达实验，采用放线菌素D（Actinomycin D）追踪实验检测VEGFA mRNA半衰期，通过RNA-FISH联合免疫荧光观察ELAVL1与VEGFA的胞质共定位，利用RIP-PCR验证ELAVL1与VEGFA mRNA的直接结合。最后，研究人员建立VEGFA过表达的KLE细胞，在亮丙瑞林处理条件下评估其对细胞增殖、迁移、凋亡和血管生成的影响，并在BALB/c裸鼠异种移植瘤模型中进行体内验证，通过免疫组化检测ELAVL1、VEGFA和CD31表达，通过免疫荧光检测Ki67和TUNEL染色评估增殖和凋亡。
研究结果分为五个部分。第一部分表明亮丙瑞林显著抑制EC细胞恶性表型：CCK-8实验显示亮丙瑞林对HEC-1A细胞的抑制作用强于HESC细胞且呈剂量依赖性；集落形成和EdU实验证实亮丙瑞林抑制细胞增殖；Transwell和伤口愈合实验显示迁移能力下降；流式细胞术显示凋亡率显著增加。第二部分表明亮丙瑞林抑制ELAVL1和VEGFA表达：TCGA-UCEC数据显示EC组织中ELAVL1表达显著高于正常子宫内膜，且ELAVL1与VEGFA表达呈正相关（R=0.43，p<0.05）；RT-qPCR和Western blot证实亮丙瑞林处理后ELAVL1和VEGFA的mRNA及蛋白水平均显著下降；HUVEC管形成实验显示血管生成能力受到抑制。第三部分证实ELAVL1直接结合并稳定VEGFA mRNA：ELAVL1敲低降低VEGFA表达并缩短其mRNA半衰期，过表达则相反；RNA-FISH联合免疫荧光显示ELAVL1与VEGFA在KLE细胞胞质中共定位；RIP-PCR证实ELAVL1与VEGFA mRNA存在直接结合。第四部分显示VEGFA过表达逆转亮丙瑞林的抗肿瘤效应：在亮丙瑞林处理条件下，VEGFA过表达细胞较对照组增殖更快、迁移能力更强、凋亡率更低，且HUVEC管形成能力增强。第五部分证实亮丙瑞林在体内通过抑制ELAVL1/VEGFA轴抑制肿瘤生长和血管生成：与对照组相比，亮丙瑞林处理组肿瘤体积和重量显著降低，而VEGFA过表达组恢复至接近对照水平；免疫组化显示处理组肿瘤组织中ELAVL1和VEGFA阳性染色面积减少，CD31评估的微血管密度降低；Ki67荧光强度下降而TUNEL阳性凋亡细胞率显著增加。
讨论部分指出，本研究首次提供了亮丙瑞林通过调节转录后调控轴抑制EC恶性进展的实验证据。传统上亮丙瑞林作为GnRH受体激动剂，通过下调垂体-性腺轴抑制雌激素合成，从而限制雌激素依赖性（I型）EC的生长。然而，当前数据显示即使在雌激素受体阴性细胞系（如HEC-1A）中，亮丙瑞林也能显著抑制增殖和侵袭，提示存在独立于激素效应的抗癌通路。亮丙瑞林在去势抵抗性前列腺癌、三阴性乳腺癌、鼻咽癌和黑色素瘤等激素非依赖性肿瘤中也表现出活性，这些肿瘤常表达异位GnRH受体。目前确认的非激素机制包括抑制增殖和抑制转移。本研究证实亮丙瑞林处理显著降低ELAVL1蛋白水平，与既往将ELAVL1与GnRH受体介导的基因调控相关联的研究一致。VEGFA被确定为介导亮丙瑞林抗肿瘤活性的关键下游效应分子，亮丙瑞林通过破坏ELAVL1介导的VEGFA mRNA稳定化来抑制血管生成和恶性表型。研究局限性包括：亮丙瑞林调控ELAVL1表达和定位的上游信号通路尚待阐明；VEGFA仅是ELAVL1众多靶点之一，其他下游因子也可能影响肿瘤进展和耐药。
结论部分总结：本研究阐明了一种不依赖激素的机制，即亮丙瑞林通过下调ELAVL1从而使关键血管生成因子VEGFA mRNA失稳，进而抑制EC进展。这些发现为EC的靶向治疗提供了新见解，并提示ELAVL1/VEGFA轴可能作为预后生物标志物和联合治疗策略的靶点。
