《Journal of Microscopy》：Single-molecule force spectroscopy of biomolecules using AFM. A multigenerational perspective
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摘要：利用原子力显微镜（AFM）的单分子力谱（SMFS）技术能够对单个分子体系直接施加并测量力，这彻底改变了我们对生物分子力学和受体-配体相互作用的认知，并开创了单分子力学生物学领域。本综述追溯了该领域的演变历程，从奠基性的里程碑实验到近期使得重新审视这些开创
摘要：利用原子力显微镜（AFM）的单分子力谱（SMFS）技术能够对单个分子体系直接施加并测量力，这彻底改变了我们对生物分子力学和受体-配体相互作用的认知，并开创了单分子力学生物学领域。本综述追溯了该领域的演变历程，从奠基性的里程碑实验到近期使得重新审视这些开创性工作的进展。研究人员讨论了塑造这一学科的关键技术进步、功能化策略及理论发展。最后，研究人员提出了未来方向，以期进一步阐明单个生物分子的结构与力学性质之间错综复杂的关系。
1 历史引言
单分子力谱（SMFS）是一类能够在单个生物分子上施加和测量力的实验技术，可直接获取其在外力下的力学性质和构象动力学。与磁镊、光镊或单分子FRET等其他SMFS技术相比，AFM提供了高力灵敏度、宽力范围、环境灵活性和高空间分辨率的独特组合。SMFS的出现得益于悬臂偏转检测方式的变革——早期AFM依赖需真空或空气环境的隧穿电流，后被可在液体中工作（从而允许在生理缓冲液中进行生物学测量）的光学检测（光束偏转或干涉法）所取代。过去30年间，SMFS取得了重要发展。两组里程碑式的实验奠定了AFM-SMFS领域的基础，为理论发展提供了数据，并改变了我们看待生物分子体系的方式。第一组实验测量了打破单个受体-配体键所需的力，先在分离体系中开展，后延伸至活细胞。第二组实验涉及单个蛋白质或蛋白结构域的机械展开，研究对象包括肌联蛋白等球状蛋白和细菌视紫红质等膜蛋白。SMFS背后的理论以及机械展开和解离过程的牵引分子动力学（SMD）模拟与实验进展相辅相成，对理解这些过程的原子细节至关重要。
2 原子力显微镜单分子力谱的原理
在AFM-SMFS实验中，单个分子或分子键被拉拽于基底与AFM悬臂针尖之间。悬臂回缩时，力通过悬臂偏转监测并逐渐施加于体系。张力增加时，分子内结构元件可顺序展开，在力-伸长曲线中产生特征峰。每个峰对应分子或复合物某一结构区域内相互作用的断裂。对于键而言，最后一个峰代表其断裂，之后力归零；对于多结构域蛋白，每个峰对应一个结构域的展开。力-伸长曲线量化了这些展开或解离力、轮廓长度增量及加载速率。通过在不同加载速率下进行实验，动态力谱（DFS）可表征底层自由能景观，确定诸如到过渡态的距离（xβ）、零力下的展开或解离速率（koff）以及自由能垒高度（ΔG?）等参数。这些参数为理解蛋白质如何响应机械应力以及力如何调控生物学功能提供了有价值的机制性见解。
3 开创性实验
探索(链霉)亲和素与生物素（SA/b）之间的解离是首个也是最具代表性的AFM-SMFS实验。作者将生物素化牛血清白蛋白（BSA）吸附于AFM针尖表面，再缀合亲和素四聚体，使暴露的亲和素分子与生物素化琼脂糖珠接触形成复合物。拉伸时，解离力在80 pN至160 pN之间变化，取决于结合分子。这些工作表明AFM能够测量单个非共价键的断裂力，直接证明了生物分子复合物的机械强度——这是整体亲和力测量无法提供的。第二个开创性实验——肌肉蛋白肌联蛋白的展开——可能更具影响力，原因在于它从不同于化学或热变性的视角触及了蛋白质折叠问题，且机械过程本身具有生物学相关性（肌联蛋白分子承受机械力以执行功能）。作者利用AFM随机抓取并拉伸兔肌肉来源的天然肌联蛋白片段，回缩针尖时观察到不同特征：首先是PEVK无序区的拉伸，随后是免疫球蛋白样（Ig）结构域以约200 pN的力顺序展开，呈现特征性的锯齿状模式。通过拉伸和释放循环，Ig结构域的展开被证明是可逆的，表明其在力释放后可重新折叠，暗示了可能的生理作用。
4 技术发展
尽管AFM系统的组件自早期工作以来未发生根本性变化，但多项改进已被开发。数字控制系统实现了更宽的带宽和更复杂的控制信号（如力钳实验）。超短悬臂的发展是一个重要进步，它们具有显著更高的共振频率和更短的响应时间，进而被用于高速力谱（HS-FS），将力测量扩展到此前不可及的亚微秒时间尺度和108 pN/s的加载速率。利用聚焦离子束（FIB）技术对超短悬臂的进一步修饰提高了SFMS的力分辨率。这些发展使得直接观察此前隐藏的亚微秒分子事件成为可能，如蛋白质展开过程中的短暂中间态和快速构象转变，从而得以重新审视早期的里程碑实验（如肌联蛋白和细菌视紫红质的展开）。HS-FS有效弥合了传统SMFS测量与计算模拟之间长期存在的实验差距，实现了直接比较。
5 表面功能化
早期SMFS研究主要依赖物理吸附的蛋白质来探测分子相互作用，但这种方法常因非特异性脱离和稳定性差而受限。为此，研究者开发了共价功能化策略，将生物分子固定在AFM针尖和模型基底上。柔性连接子（最常用的是聚乙二醇PEG）的引入是一个重大进步，它能控制分子密度以确保单分子测量，赋予目标分子构象灵活性，并通过减少空间位阻和表面诱导变性来保持天然结构。此外，连接子还提供特异性指纹：例如PEG的特征轮廓长度有助于区分特异与非特异相互作用。最新创新涉及工程化生物分子和位点特异性标签的使用，实现生物分子的定向固定，精确控制拉力几何方向。Sedlak等人通过从链霉亲和素分子的特定位置（N端或C端）进行拉伸，发现解离力随拉力加载位置的不同而显著变化。超稳定键的发现也使得从相同位点拉伸和展开蛋白质成为可能，显著提高了统计性和可重复性。表面功能化策略与AFM扫描能力的结合催生了利用力映射的识别成像技术，最初在微图案化表面上开发，后应用于活细胞，现已发展到可检测蛋白质内部的单个结合位点。
6 理论发展
自首批实验以来，外力驱动展开和解离的理论不断演进。Lee等人在SA/b体系上的开创性工作通过Bell模型提供了对解离力更准确的解释，后续研究进一步确立了时间尺度在解离过程中的重要性。动态实验显示断裂力随加载速率的对数增加而增大，因此断裂力依赖于时间尺度，并非受体-配体键的内在属性。Bell关于键寿命在外力下呈指数衰减的经典描述被Evans扩展至随时间变化的力增加条件，建立了DFS。Evans还提出沿能量景观可能存在多个能垒，每个能垒对应一个加载速率区间。后来采用有限自由能垒高度和随力减小到过渡态距离的更现实模型，导致动态力谱中出现曲率。Friddle等人挑战了忽略再结合的假设，预测了近平衡区间的存在：当再结合速率快于解离速率时，解离力恒定不依赖于加载速率。在超高速度的另一端，热涨落可忽略不计，预期出现漂移或确定性区间。HS-FS的发展使得对该区间的实验探索成为可能。值得注意的是，虽然大多数模型意味着外力加速解离，但AFM实验揭示了自然界设计的其他解离机制，如捕获键——其强度随力增大而增强。
7 单分子力谱与牵引分子动力学模拟的结合
牵引分子动力学（SMD）在首批AFM实验后不久便作为一项计算技术应运而生，能够模拟SMFS实验。SMD中，选定原子通过虚拟弹簧受到受控力。AFM-SMFS直接测量单个分子的力学响应，而SMD则提供关于展开或解离事件背后结构重排的原子级信息。两者结合可将实验观测到的力峰与模拟中识别的具体分子事件和结构转变相关联。长期以来，比较SMD与SMFS结果的一大挑战是可达时间尺度的巨大差异——由于计算限制，SMD的拉伸速度通常比常规AFM实验高出数个数量级，导致更高的展开力和不同的展开路径。HS-FS通过将实验测量延伸至接近模拟可及的加载速率区间填补了这一空白，使得能够在毫米/秒的拉伸速度下重新审视肌联蛋白的开创性展开工作，并与长时间SMD模拟直接对比。在SA/b案例中，HS-FS和SMD重新诠释了解离机制，揭示了异质性且依赖加载速率的路径，而位点定向拉伸则揭示了依赖方向的解离力，再次展现出比最初设想更为复杂的本质。
8 未来展望
技术、实验和理论的发展使我们能够更好地理解SMFS结果，从奠定基础的简单解释转向揭示即使是最简单生物分子体系复杂性的更精细框架。未来将带来由实验指导并反哺实验的进一步理论发展。可能出现基于不同于悬臂偏转检测的物理原理、具有更高共振频率的更稳健和多功能探针，从而提供更快拉伸速度和更短时间尺度。另一方面，超级计算机算力的提升有望进一步降低SMD模拟的速度以接近常规AFM的时间尺度。人工智能很可能在未来40年内被引入SMFS实验的控制、设计、分析和解释中，为连接实验、理论和模拟提供额外维度。开放共享的结果、AFM的普及以及实验和数据分析流程的标准化，对于拓宽SMFS在生物学中的应用十分必要，这将弥合力谱与细胞生物学之间的鸿沟，提供探索单生物分子复杂性前沿所需的力学透镜。
