《Journal of Microscopy》：How AFM has contributed to the understanding of bacterial cell wall peptidoglycan structure
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细菌细胞壁是一种至关重要的外骨骼，在赋予细胞形态方面发挥主要作用，并作为主要的承力层，抵抗由细胞内部与周围介质之间分子浓度失衡所产生的好几个大气压的膨压（turgor pressure），同时在宿主与病原体相互作用中发挥核心作用。在过去二十年中，原子力显微镜（
细菌细胞壁是一种至关重要的外骨骼，在赋予细胞形态方面发挥主要作用，并作为主要的承力层，抵抗由细胞内部与周围介质之间分子浓度失衡所产生的好几个大气压的膨压（turgor pressure），同时在宿主与病原体相互作用中发挥核心作用。在过去二十年中，原子力显微镜（atomic force microscopy, AFM）所提供的多功能工具箱助力研究人员深入理解细菌细胞壁肽聚糖（peptidoglycan, PG），揭示了其精细的纳米级结构，以及其在细菌生命、死亡以及对抗生素抗性中的作用——为发现新的潜在抗菌靶点铺平了道路。本文综述了原子力显微镜（AFM）在细菌细胞壁肽聚糖结构成像方面的最新进展，并特别聚焦于世界卫生组织（World Health Organization, WHO）优先病原体——耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（Methicillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA）和大肠杆菌（Escherichia coli, E. coli）。
1 引言（INTRODUCTION）
本部分首先指出，理解细菌细胞壁的纳米级结构与力学特性一直是细菌生物物理学家与微生物学家关注的重要问题，因为其答案可为设计新抗生素开辟途径，从而助力应对超级细菌（superbugs）的出现与传播。自40年前问世以来，原子力显微镜（AFM）一直有望在天然环境下以分子尺度对活细胞进行成像，而细菌因其力学上坚固且相对刚性的膜结构，成为该技术的理想研究对象。与需要高真空且常需剧烈样品制备（可能改变细胞壁固有超微结构）的透射电子显微镜（transmission electron microscopy, TEM）和扫描电子显微镜（scanning electron microscopy, SEM）不同，AFM在过去多年中极大推进了研究人员对细菌细胞壁生物物理学的理解，使研究人员能够在生理条件下、无需标记或高度扰动样品制备的情况下，获取细胞壁的纳米级时空分子组织信息。除静态纳米级结构外，AFM还提供了一套丰富的无标记工具箱，可在细胞分裂、渗透条件变化和抗生素作用等动态生物过程期间追踪细胞壁的理化性质。根据研究问题、样品性质及所需生理条件的不同，AFM提供多种适于不同生物应用的成像模式：从最初的接触模式（contact mode），到降低横向力的振幅调制（amplitude modulation，又称轻敲（tapping））模式，再到近期基于力的成像模式，如PeakForce轻敲（PeakForce tapping, PFT）和定量成像（Quantitative Imaging, QI）模式，它们建立在常规力-体积成像（force-volume imaging）以及"跳跃模式"（jumping-mode）和脉冲力模式（pulsed force mode）等进一步改进的基础之上。本文聚焦于AFM在细菌细胞壁研究中的应用，以不同成像模式为线索，在有限篇幅内重点介绍研究人员自身的工作并兼顾更宏观的背景，同时展望该领域未来数年的发展。
1.1 细菌细胞壁简介（A brief introduction to the bacterial cell wall）
细菌细胞壁是一种复杂的生物聚合物，环绕细胞，赋予并维持细胞形态，并作为承载结构防止细胞因内部膨压而裂解。大多数细菌细胞壁的主要结构成分是肽聚糖（PG），这是一种肽高度交联的多糖，在细菌域（bacterial domain）中普遍存在且具有一定的化学变异。革兰氏阳性（Gram-positive）单膜（monoderm）细菌（如金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis））具有数纳米至数十纳米厚的三维网格（3D-mesh）肽聚糖，环绕细胞质（内膜）并承载细胞内部的渗透压。革兰氏阴性（Gram-negative）双膜（diderm）细菌（如大肠杆菌（Escherichia coli））同样具有内膜，但其肽聚糖层为夹在内膜与外壁之间的极薄三维网格层；内膜与外壁之间的空间称为周质（periplasm），容纳包括脂蛋白和跨膜复合物（如Tol-Pal）在内的蛋白质，它们以物理非共价方式连接内外膜，维持细胞壁完整性并协调分裂。革兰氏阴性与革兰氏阳性细胞还可具有胞外层，如荚膜（capsules）和S层（S-layers），其锚定机制取决于细胞壁类型：革兰氏阴性细菌中，荚膜共价锚定于外壁，S层非共价锚定于外壁；革兰氏阳性细菌中，荚膜共价锚定于PG，S层非共价锚定于PG。
2 细菌细胞壁的接触模式成像（CONTACT MODE IMAGING OF THE BACTERIAL CELL WALL）
接触模式是AFM最经典、最早开发的模式，其探针针尖始终与样品接触，反馈系统通过用户设定的"setpoint"维持恒定力。由于针尖与样品的持续接触，横向力可能很高并损伤样品，但尽管存在这一局限，接触模式仍被用于以亚纳米级横向分辨率对多种软生物系统成像，包括细菌S层蛋白晶体。该模式还用于捕捉金黄色葡萄球菌细胞生长与分裂过程中伴随的细胞壁结构变化：研究中将细胞捕获于多孔膜内，以避免针尖横向运动带动细胞；对母细胞生长、分裂及随后一分为二形成两个子细胞过程的连续成像，揭示了隔膜外表面与成熟细胞外周表面之间显著的结构差异——隔膜外表面以同心环为特征，中心有环形凹陷，而较老细胞壁呈凝胶状结构，具有不同的黏附性质。随后，Dufène等人证实了相同的隔膜同心环结构，并追踪了金黄色葡萄球菌暴露于溶葡萄球菌酶（Lysostaphin，一种切割金黄色葡萄球菌肽聚糖中五甘氨酸交联桥的水解酶）时的生物物理变化，首次将AFM应用于活细菌细胞过程追踪，研究显示在PG上出现穿孔孔洞，导致渗透压脆弱、高细胞体积的细胞。此后，Kailas等人利用实时AFM成像揭示了正交分裂平面的细胞分裂。除结构差异外，架构差异可能反映可变的力学特性，AFM为以空间分辨方式直接探索纳米力学提供了独特机会。通过力-距离（force-distance, F-D）曲线，研究人员可测量接触刚度、杨氏模量（Young's modulus）、黏附力与耗散能等生物物理特性。然而，许多用于提取杨氏模量等力学特性的接触力学模型最初是为固体材料开发的，不适用于细菌细胞壁这类柔软、异质、黏弹性且受压的生物聚合物；近年来，弹性壳理论（elastic shell theory）与受压弹性理论（pressurised elastic theory）被应用于估计植物细胞与酵母细胞的细胞壁刚度、杨氏模量与膨压，对细菌细胞更具相关性。利用力谱与力图谱模式，研究显示整个细胞各部分的压痕刚度无差异；而新暴露隔膜环的局部刚度显著高于周围较老、成熟的细胞壁。后续研究进一步表明，缺乏重要水解酶的金黄色葡萄球菌突变株相较于亲本菌株具有更高的局部细胞刚度，凸显了传统微生物学机制研究与AFM细胞壁力学直接测量能力的结合价值。尽管接触模式为细菌结构提供了以往无法获得的信息，但其高横向力在高起伏细菌细胞壁表面上阻碍了高分辨率成像；而研究人员开发的细菌隔离与力学固定方法足以承受高横向力，为迈向更高图像分辨率奠定了基础。
2.1 细菌细胞壁的轻敲模式成像（Tapping mode imaging of the bacterial cell wall）
在AFM发展早期，人们意识到在接近共振频率处机械振荡悬臂梁（cantilever）并以振幅作为反馈信号，可提高对针尖-表面力的敏感性；允许与表面接触（大多数使用场景下均会发生）可降低横向力，由此产生了"轻敲模式"（tapping mode）这一名称，亦被称为振幅调制模式、交流模式（AC mode）或动态模式（dynamic mode）。在该模式中，悬臂梁在接近其共振频率处受驱振荡，振荡针尖以间歇接触方式扫描样品，轻敲振幅作为反馈信号，监测悬臂梁驱动与响应之间的相位差可获取表面力学与黏附变化的信息。在细菌研究中，轻敲模式减少了表面的变形，这对于由丝状网格构成、在横向力作用下易发生重组的细胞壁尤为重要；横向力的降低也放松了对刚性表面固定的要求，或为部分固定的样品提供了更大的样品稳定性，这可能是分辨率提升的关键因素。Hayhurst等人率先在空气中使用轻敲模式探索枯草芽孢杆菌提取纯化的PG不同表面，显示细胞壁内表面具有长缆状特征，垂直于细胞长轴定向；而外表面则呈非常粗糙的纹理，圆柱部分无长缆结构。Turner等人于2010年采用相同样品制备与成像模式，观察到金黄色葡萄球菌PG的不同表面纹理：新生隔膜内的局部纳米特征（同心环）、成熟细胞壁肽聚糖特有的结节状表面纹理，以及标志着隔膜内陷起始的明显"饼壳"（piecrust）脊状纹理。该研究还追踪了溶菌酶（lysozyme）对大肠杆菌PG的活性，报道PG被消化直至出现穿孔孔洞并溶解；此外对提取PG囊（sacculi）的成像显示，沿杆状细胞体的聚糖链（glycan strands）大致沿细胞长轴周向定向，两条平行聚糖链之间的间距约为2.5 nm，首次揭示了近乎完整的细菌细胞壁的聚糖组织。对活细胞的轻敲模式成像研究揭示了新的见解：Turner等人在优化细胞固定方法的基础上获得了更详细的同心环架构与细胞分裂图像；Pasquina Lemonche、Burns等人采用小轻敲振幅成像获得了极高横向分辨率的同心隔膜环图像，揭示了与肽聚糖
4-1螺旋螺距（helical pitch）相关的周期结构（约4 nm周期峰沿聚糖链排列）；细胞外周则与多孔开放网格相关，纤维随机分布，部分孔洞几乎穿透整个细胞壁。同一研究显示枯草芽孢杆菌细胞壁外表面的位置依赖架构：极区以同心环为特征，而圆柱细胞体呈开放网格结构并分布孔隙。实现活细胞成像的关键在于化学固定策略——采用源自贻贝的多酚蛋白溶液Cell-Tak"生物胶水"，通过静电与疏水/多酚相互作用将带负电的细胞壁固定；其他固定机制还包括聚-L-赖氨酸（poly-L-lysine）、聚-L-鸟氨酸（poly-L-ornithine）、聚鸟氨酸（polyornithine）、聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane, PDMS）疏水包被以及vectabond和明胶等。然而，当轻敲模式用于提取细胞壁囊（成像细胞膜面向内表面及最新合成细胞壁结构所必需）时效果有限：细胞壁在渗透压下合成，提取后应力释放导致细胞壁沿径向大幅膨胀，形成高度力学各向异性的结构，而基于力的成像模式（具有更大的垂直运动范围）在此更为成功。
3 定量成像与PeakForce轻敲模式用于细菌细胞壁成像（QUANTITATIVE IMAGING AND PEAKFORCE TAPPING MODE FOR IMAGING THE BACTERIAL CELL WALL）
定量成像（QI）模式下，针尖以线性恒速接近样品、压入样品并以同样恒速离开，在每个像素获得完整的力-距离（F-D）曲线，且横向力影响极小。Peakforce轻敲（PFT）模式下，探针以远低于共振频率的频率（0.5–8 kHz）正弦振荡，以间歇接触方式轻敲样品，并在每次振荡时记录（重度滤波的）F-D曲线，以每次轻敲的峰值力作为反馈回路参数。两种模式的主要区别在于探针接近/离开样品的运动方式、成像速度（每秒曲线数）及Z范围（获取下一像素F-D曲线前探针回缩的安全高度）。Pasquina-Lemonche等人利用PFT揭示了革兰氏阳性细菌细胞壁纯化PG的详细架构：内表面隔膜为致密网格，由随机定向的链组成，形成的孔隙远小于细胞外周表面的旧PG；枯草芽孢杆菌圆柱体内表面由垂直于细胞长轴定向的链组成，而金黄色葡萄球菌内表面为致密随机定向链的网格，隔膜与其余细胞壁之间区分不大。同一作者还利用PFT探究了抗生素对细胞壁结构完整性的作用模式，对暴露于甲氧西林（methicillin，β-内酰胺类）和万古霉素（vancomycin，糖肽类）后的金黄色葡萄球菌纯化PG成像，显示60分钟暴露后在隔膜与细胞外周出现穿孔孔洞，意味着转肽酶活性被甲氧西林抑制而PG水解酶持续活动导致细胞死亡。针对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA），PFT成像显示MRSA通过替代模式逃避抗生素杀伤作用，即以隔膜壁外表面为致密紧密网格（而非通常观察到的隔膜同心环）的方式进行分裂，其霉素处理后MRSA细胞壁新生隔膜外表面的致密紧密网格取代了未处理细胞的同心环。
4 展望（PERSPECTIVES）
AFM提供了一套以纳米米级分辨率揭示细菌细胞表面的成像工具，为纯化提取细胞壁与活细菌细胞在不同生理与渗透条件下的超微结构提供了独特见解；除单分子分辨率成像外，力谱模式还可用于探测细胞经历不同生长与分裂阶段时不同表面特征的纳米力学特性，AFM的无可比拟的能力在于绘制细菌细胞壁结构、分裂动态与实时抗生素效应图谱。
现有且不断发展的研究方向包括高速AFM（high-speed AFM, HS-AFM）捕捉具有生物学相关时间分辨率的细菌细胞表面实时纳米级变化，已用于研究抗菌肽对大肠杆菌活细胞的杀伤动力学、直接可视化磁螺菌（Magnetospirillum magneticum）AMB-1细胞外壁外膜外表面的分子动力学、研究抗生素与抗菌肽对脂质双分子层的分子作用，以及记录活大肠杆菌的纳米力学特性与外膜分裂、孔形成与扩散的形貌变化，为研究细胞周期不同阶段细胞壁重塑及抗生素暴露期间细胞壁水解的实时观察提供了独特机遇。另一互补的AFM技术是单分子定位显微镜（single-molecule localisation microscopy, SMLM）与AFM的结合：AFM解析细胞壁超微结构并探测其精细结构的力学特性，SMLM则增加了在衍射极限（空间分辨率约20–30 nm）以下对细胞周期或抗生素存在期间新插入细胞壁材料或合成细胞壁的蛋白质进行可视化的维度。Turner等人利用随机光学重建显微镜（stochastic optical reconstruction microscopy, STORM）表征荧光万古霉素标记的肽聚糖，确定大肠杆菌与新月柄杆菌（Caulobacter crescentus）中新生聚糖在PG上的掺入位置，发现圆柱细胞壁上有多个不同的新生肽聚糖插入灶。Tank等人开发了STORMForce与结构光照明显微镜（structured illumination microscopy, SIM）结合AFM的技术，通过成像掺入细胞壁的荧光D-氨基酸衍生物（fluorescent D-amino acids, FDAAs）绘制枯草芽孢杆菌生长与分裂期间的新生肽聚糖，发现枯草芽孢杆菌隔膜形成分两个顺序阶段：第一阶段在新隔膜前缘掺入新物质，第二阶段填充第一阶段前缘后方随机分布的大孔，形成隔膜内表面均匀架构。Odermatt等人开发了PALM/AFM技术，利用光激活定位显微镜（photoactivated localization microscopy, PALM）绘制融合蛋白RNP
mEOS2的表达分布，同时用AFM成像缓冲液中固定大肠杆菌的三维形貌，获得3D表面地形与2D表达水平分布的相关叠加图谱，在化学特异性与纳米级结构之间架起桥梁。
AFM虽在细胞壁表面具有纳米级分辨率，但目前尚不清楚细胞壁深度方向的化学异质性如何影响其固有力学特性。为解决这一问题，散射型扫描近场光学显微镜（scattering-type scanning near-field optical microscopy, s-SNOM）与AFM-红外光谱（AFM-IR）作为将AFM高空间分辨率与红外光谱化学识别相结合的先进表征技术应运而生。s-SNOM中，外部激光束聚焦于AFM针尖顶端，针尖在样品表面附近振荡时诱导的极化耦回针尖，进一步增强电场；通过解耦高阶谐波信号，该方法可分离细菌细胞壁内不同的结构层，揭示纳米与微米长度尺度上局部化的化学与力学异质性，例如在空气中对金黄色葡萄球菌纯化囊成像时显示酰胺（amides）与磷酸盐（phosphates）等功能基团密度的化学对比图；s-SNOM与AFM-IR的区别在于前者对体积敏感而后者对表面敏感。AFM-IR中，脉冲激光束以与悬臂梁共振特性相关的频率照射样品，取决于样品中存在的官能团，光被吸收并发生快速的局部热膨胀；通过将红外激光源调谐至特定目标波数，系统以化学映射模式运行，例如显示目标分子振动精确空间分布的红外振幅图像，以及通过在单一坐标暂停针尖并扫描激光生成的局部高分辨红外光谱。
限制AFM在微生物学中广泛应用的另一障碍是其对专门用户专业知识、复杂参数调节与频繁仪器故障排除的依赖。将AFM从专家驱动的技术转变为常规、高通量、可及的平台，人工智能（artificial intelligence, AI）与机器学习（machine learning, ML）提供了充满前景的途径，可应用于数据分析、数据可视化与结果解读，形成标准化的AFM操作，使AFM在微生物学领域得到广泛应用；自动图像分析还可通过识别重复图案以及PG网络中的连接/交叉线（节点，nodes）去除耗时的手动过程，并将可识别的物体（孔隙、短链、长链、取向等）与噪声分类，使亚纳米级的位置依赖特征得以显现。
4.1 未来（The future）
自AFM 40年前诞生以来，其潜力已在多个领域得以实现，同时技术不断精进发展。在细菌细胞壁研究领域，AFM对细胞壁的纳米级架构与力学理解具有革命性意义，为阐明细菌形态、生长分裂、抗生素作用及抗菌抗性机制的基本生物物理参数提供了独特见解。未来40年，最先进AFM的持续开发与应用将为理解细菌生命基本规律作出关键贡献。
