深共熔溶剂（DES）预处理开心果壳生产第二代生物乙醇：氯化胆碱/柠檬酸体系结构改性及分步与同步糖化发酵评价

《Next Materials》：Pretreatment of pistachio (Pistacia vera) shells using Deep Eutectic Solvents (DES) for the production of second-generation bioethanol

　　

• 采用深共熔溶剂（Deep Eutectic Solvents，DES）预处理开心果（Pistacia vera）壳可增强木质素去除并提高结晶度指数（Crystallinity Index，CrI）（约28%）。• 以1:2摩尔比的氯化胆碱–柠檬酸DES处理2 h可获得最佳结构改性。• 优化纤维素酶水解可从开心果壳获得高达约24.8 g/L的还原糖。• 分步糖化发酵（Separate Hydrolysis and Fermentation，SHF）获得约28.6 g/L乙醇；同步糖化发酵（Simultaneous Saccharification and Fermentation，SSF）在72 h后略高，约29.8 g/L。• 基于DES的方法为废弃物木质纤维素生物质（Lignocellulosic Biomass，LB）生产第二代（2 G）生物乙醇提供了更绿色、更高效的途径。

研究背景方面，化石燃料长期满足能源需求，但其大量使用带来气候变化、空气污染和资源枯竭等问题，并释放过量二氧化碳（CO₂）等温室气体。因此，寻找环境友好的替代能源成为重要方向，第二代生物乙醇是交通领域颇具潜力的替代燃料之一。第二代生物乙醇主要来自木质纤维素生物质（Lignocellulosic Biomass，LB），其由纤维素、半纤维素和木质素构成；其中木质素位于外层且结构复杂，会阻碍生物质碳水化合物的有效利用，因此脱木质素预处理是生物乙醇生产的关键环节。传统物理、酸、碱及化学预处理可能带来环境风险。深共熔溶剂（Deep Eutectic Solvents，DES）由一定摩尔比的氢键供体（Hydrogen Bonding Donor，HBD）和氢键受体（Hydrogen Bonding Acceptor，HBA）形成，被视为较环境友好的脱木质素溶剂。开心果壳年产量约660,000吨，常未充分利用，且纤维素含量较高（60.62%），具有转化为第二代生物乙醇的潜力；但针对开心果壳废弃物的氯化胆碱（choline chloride，Cch）基DES体系研究仍相对有限。基于此，Sana Riaz等开展了Cch基DES组成、预处理时间、开心果壳结构改性及后续乙醇生产的综合评估，以期实现开心果壳增值利用并比较不同DES预处理效果。该研究的重要意义在于为废弃LB转化为第二代生物乙醇提供较绿色、有效的预处理路线，并比较SHF与SSF的生产表现。

关键技术与方法可概括为：研究人员采集印度泰米尔纳德邦Potheri、SRM Institute of Science and Technology校园附近的开心果壳，经清洗、风干、粉碎和筛分（约425–600 μm）后作为LB底物；制备Cch/LA（lactic acid，LA）和Cch/CA（citric acid，CA）DES，并在1:2和1:8摩尔比、2 h和4 h条件下预处理；采用傅里叶变换红外光谱（Fourier Transform Infrared，FTIR）、X射线衍射（X-ray Diffraction，XRD）和高分辨扫描电子显微镜（High-Resolution Scanning Electron Microscope，HRSEM）表征结构与形貌，XRD用于计算CrI；优化初始pH和温度后，用Aspergillus niger纤维素酶进行酶解，以3,5-二硝基水杨酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）法测还原糖；用Saccharomyces cerevisiae进行SHF和SSF，以K₂Cr₂O₇比色法测乙醇，并采用双因素方差分析进行统计比较。

研究结果如下。3.1 FTIR analysis（FTIR分析）：通过比较未处理与不同DES预处理样品的FTIR谱，约3328 cm^?1的–OH吸收表明纤维素结构基本保持；约1602 cm^?1提示木质素脂肪族侧链可能在预处理中断裂；约1728 cm^?1信号减弱提示半纤维素部分去除或降解；约1438 cm^?1芳香骨架振动仍存在，说明木质素核心未完全破坏。3.2 X-ray diffraction analysis of LB（LB的XRD分析）：XRD显示16°和22°附近分别对应非晶区和结晶区，22°特征峰基本不变；所有DES预处理样品CrI均高于未处理样品（21.67%），相对提高约25–30%，绝对提高约5–7个百分点；1:2 Cch/CA处理2 h的CrI最高（28.46%），其次为1:2 Cch/LA处理2 h（27.97%），说明1:2摩尔比和2 h更优，CrI升高与非晶态半纤维素和木质素去除有关。3.3 Morphological study of LB pre and post pretreatment（预处理前后LB形貌研究）：HRSEM显示未处理LB表面光滑致密、纤维排列较高；DES预处理后表面不平整并出现孔隙，结构更松弛无序，有利于酶接触；但本研究未定量测定纤维素、半纤维素和木质素，故不能定量确定各组分去除程度。3.4 Optimal pH and temperature conditions（最佳pH和温度条件）：通过DNS法测定不同pH和温度下还原糖释放，在测试条件下初始pH 9时还原糖最高，故选用Tris-HCl pH 9缓冲液；30°C时酶–底物活性最高；原文同时指出pH 9仅为实验条件下最佳初始pH，并非该酶确定性的最适pH，仍需pH监测和对照研究。3.5 Enzymatic hydrolysis（酶解）：48 h酶解后，所有预处理样品还原糖均高于未处理样品（10.97 g/L）；1:2 Cch/CA处理2 h释放还原糖最高（24.84 g/L），其次为1:2 Cch/LA处理2 h（21.48 g/L）；延长至4 h产量下降，可能与糖损失、生物质降解及糠醛和羟甲基糠醛（hydroxymethylfurfural，HMF）等抑制物形成有关。3.6 Ethanol fermentation（乙醇发酵）：采用Saccharomyces cerevisiae进行SHF，K₂Cr₂O₇比色显示72 h时乙醇最高；所有DES预处理样品乙醇浓度均高于未处理样品（22.20 g/L）；1:2 Cch/CA处理2 h最高（约28.60 g/L），其次为1:2 Cch/LA处理2 h（约27.64 g/L），最佳SHF条件下72 h乙醇生产率约0.4 g/L/h；随发酵进行，还原糖被消耗而乙醇增加。3.7 Simultaneous saccharification and fermentation (SSF)（同步糖化发酵）：SSF在30°C下同时进行水解和发酵，以K₂Cr₂O₇比色测乙醇；1:2 Cch/CA处理2 h样品在72 h达到约29.82 g/L，略高于SHF；SSF可及时利用释放的糖并减少水解产物对纤维素酶的抑制，从而简化流程、降低成本并提高效率。

讨论部分总结：DES预处理机制受Kamlet-Taft参数（氢键供体能力α、氢键受体能力β和溶剂极性π）影响；DES中氯离子可与木质素羟基形成氢键，LA和CA的酸性质子可促进部分木质素–碳水化合物连接断裂，增强木质素增溶并提高纤维素可及性；不同DES、摩尔比和时间的效果差异可能与氢键作用、酸性和木质素/半纤维素破坏程度有关。DES具有制备简单、成本较低、可回收和有效破坏LB等优点，但存在溶剂回收、残留DES和生物质特异性优化等挑战；实际应用还需考虑能耗、废弃物产生、DES回收复用、较高底物负载、能量高效处理以及技术经济和生命周期评估。SSF通过整合水解和发酵减少设备与操作成本，并减少抑制性化学物积累，从而提高乙醇生产。

研究结论部分翻译：本研究聚焦于采用基于Cch的DES对开心果壳LB进行预处理以生产生物乙醇。因此，该研究证明了DES预处理LB在有效生产生物乙醇方面具有巨大潜力。生物乙醇生产过程中的主要瓶颈和最昂贵阶段是预处理，DES预处理正成为应对该挑战的有前景方案，可提升LB生物乙醇生产的可持续性和经济可行性。DES预处理LB用于生物乙醇生产仍存在一些缺点，如木质纤维素生物质的顽抗性、酶和预处理成本较高，以及乙醇产量低于传统方法。通过进一步研究，采用集成预处理流程有望使预处理过程更具经济可行性。进一步研究和放大工业应用可帮助实现可持续发展目标，并使LB生物乙醇的商业化可行生产成为可能。