《Gene Therapy》：AAV8-PDE6B with 3’UTR provides rescue of photoreceptor structure and function in the rd10 mouse model of retinitis pigmentosa
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视网膜色素变性（retinitis pigmentosa, RP）是遗传性失明的主要原因之一，其中一部分病例由磷酸二酯酶6（phosphodiesterase 6, PDE6）缺陷导致。研究人员在rd10小鼠模型中评估了一种新型基因治疗构建体AAV8-RK-P
视网膜色素变性（retinitis pigmentosa, RP）是遗传性失明的主要原因之一，其中一部分病例由磷酸二酯酶6（phosphodiesterase 6, PDE6）缺陷导致。研究人员在rd10小鼠模型中评估了一种新型基因治疗构建体AAV8-RK-PDE6B-3′UTR；该模型具有纯合错义变异，破坏PDE6 β亚基的功能。该构建体使用视紫红质激酶启动子（rhodopsin-kinase promoter）、人PDE6B cDNA和PDE6B 3′非翻译区（3′ untranslated region, 3′UTR），于出生后第12天（postnatal day 12, P12）经视网膜下递送。经视觉敏锐度（visual acuity, VA）、视网膜电图（electroretinography, ERG）、光学相干断层扫描（optical coherence tomography, OCT）和免疫组织化学证实，治疗小鼠表现出视网膜功能和结构持续保存长达15个月。这是rd10模型中AAV介导PDE6B基因补充所报道的最长功能和结构随访。PDE6B 3′UTR的加入增加了体外PDE6B表达，并改善了治疗后4周测试中的功能性挽救。这些数据表明，此处所述的载体衣壳类型、光感受器特异性启动子以及PDE6B 3′UTR序列的组合可能在PDE6B基因治疗中带来疗效获益。
视网膜色素变性（retinitis pigmentosa, RP）是一组以视杆光感受器进行性变性及随后视锥光感受器丢失为特征的遗传性视网膜疾病（inherited retinal diseases, IRDs）。RP通常早期表现为夜盲，随后周边视野恶化，并可进展至完全失明。约4–5%的RP病例由视杆磷酸二酯酶6复合体（phosphodiesterase 6 complex, PDE6）亚基的致病性变异导致，其中多数累及β亚基，形成常染色体隐性PDE6B相关RP。PDE6B功能缺失可导致环鸟苷酸（cyclic guanosine monophosphate, cGMP）毒性蓄积及细胞内钙介导的细胞死亡。rd10小鼠Pde6b外显子13存在纯合致病性错义变异，出生2周后发生视网膜变性，为测试疗效和持续时间提供了时间窗。IRDs基因治疗主要依赖病毒介导递送，其中腺相关病毒（adeno-associated virus, AAV）是最常用载体；AAV8经视网膜下注射后较AAV2和AAV5更有效转导光感受器和视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium, RPE）细胞，但长期稳定表达仍是挑战。既往rd10模型PDE6B基因治疗采用酪氨酸衣壳突变AAV8（Y733F）和泛表达smCBA启动子，功能随访至6个月；PDE6B缺陷犬模型曾用AAV5和光感受器特异性启动子恢复视力，但相关临床试验已终止。基于眼部基因治疗持久性 concerns，研究人员采用标准（非工程化）AAV8衣壳、光感受器特异性启动子和基因天然调控元件，并延长随访，以推进临床转化。人视紫红质激酶（rhodopsin kinase, RK/GRK1）启动子较紧凑，适合AAV约4.5 kB包装限制，可在小鼠、犬和非人灵长类视杆和视锥中驱动表达，并已用于RP的I/II期试验AAV构建体。PDE6B亚基表达受UTR依赖的转录后调控，PDE6B 3′UTR内致病性缺失可导致早发性视杆-视锥变性，提示该区域对PDE6B表达具有功能重要性。因此，研究人员报道在rd10小鼠RP模型中使用含PDE6B 3′UTR序列的新型PDE6B基因治疗载体构建体，发现该构建体可长期保存视杆和视锥光感受器及PDE6B稳定表达至15个月，视网膜内未检测到不良炎症反应，视网膜结构和视觉功能在此期间维持，提示治疗干预成功且持续。
研究人员开展的核心研究是评估AAV8-RK-PDE6B-3′UTR在rd10小鼠中的长期疗效，并与无3′UTR、GFP替代3′UTR、RK-GFP-pA-stuffer及CMV-GFP等构建体进行体外和早期体内筛选。结论是含PDE6B 3′UTR的构建体在体外增加PDE6B表达，在4周时改善功能挽救，并在长达15个月内维持视网膜功能、结构、PDE6B表达及功能，减少炎症并保存视锥和视杆双极细胞；其意义在于为PDE6B相关RP提供了一种具有长期疗效证据的优化光感受器靶向基因补充策略，并支持进一步临床前开发。
关键技术方法概括（不超过250字）：研究使用C57BL/6（Animal Resources Centre, Western Australia）与rd10（Jackson Labs, ME, US）小鼠，以及661W小鼠光感受器细胞系（由Prof. Muayyad R. Al-Ubaidi, University of Houston, TX, USA惠赠）。关键技术包括构建并包装AAV8-RK-PDE6B-3′UTR及对照AAV载体；在661W细胞中体外筛选PDE6B表达；对P12 rd10小鼠行视网膜下注射1.8×10
10 genome copies（GC）；纵向开展视动反应、ERG、OCT/眼底成像和免疫组织化学，并进行定量统计。实验在治疗后1、2、6、9、12和15个月等时间点评估，长期体内研究每条件评估5眼。
研究结果如下。AAV8-RK-PDE6B-3′UTR provided greater PDE6B expression in cells and rd10 mouse retina：通过661W细胞转导后的免疫组织化学、RT-qPCR和流式细胞术，以及P12 rd10小鼠视网膜下注射后4周暗视ERG和免疫组织化学筛选，发现含3′UTR构建体较无3′UTR或GFP替代3′UTR等构建体显著增加PDE6B RNA和蛋白表达，并带来更优的早期暗视b波挽救。AAV8-RK-PDE6B-3′UTR maintained improved retinal function over the long-term：通过视动反应检测视觉敏锐度和暗视/明视ERG在4周至15个月纵向随访，治疗眼视觉敏锐度及暗视、明视b波反应显著优于未治疗对侧眼，提示视杆和视锥光感受器功能均获挽救；因仅约三分之一视网膜受治疗，野生型C57Bl/6对照反应仍优于治疗眼。Retinal structure preserved in areas of AAV8-RK-PDE6B-3′UTR treatment in rd10 eyes：通过眼底成像和OCT纵向观察至15个月，治疗区视网膜层结构和形态基本维持，外核层（outer nuclear layer, ONL）厚度在各时间点显著高于未治疗眼，未治疗眼出现明显视网膜变薄和光感受器层缺失。PDE6B expression observed in rescued photoreceptors of AAV8-RK-PDE6B-3′UTR treated rd10 mice：通过多标记免疫组织化学在4周和15个月检测，治疗眼PDE6B与视紫红质（rhodopsin）共定位于光感受器外段（outer segment, OS），PDE6B表达强度持续，未治疗眼缺乏视紫红质阳性光感受器且PDE6B表达极少；挽救局限于注射部位附近，远离注射部位无挽救。PDE6B function was rescued and maintained in AAV8-RK-PDE6B-3′UTR treated rd10 retina：通过cGMP免疫组织化学在15个月检测，治疗眼ONL和OS区cGMP水平显著降低至接近对照，未治疗P18 rd10眼ONL和OS区显示cGMP蓄积，提示治疗眼存在功能性PDE6B并减少cGMP蓄积。Reduced inflammatory cells and maintenance of cone photoreceptors and rod bipolar cells was evident in AAV8-RK-PDE6B-3′UTR treated rd10 retina：通过Iba1、GFAP、cone arrestin和PKCα免疫组织化学在4周和15个月检测，治疗眼15个月时小胶质细胞密度和Müller胶质活化降低，视锥光感受器和视杆双极细胞得到保存且层状结构维持；4周时治疗眼和未治疗眼炎症标志仍高，15个月时治疗眼降低，未治疗眼持续高炎症和细胞丢失。
讨论部分总结：该研究在rd10小鼠中证明AAV8-RK-PDE6B-3′UTR可长期恢复视觉并维持视网膜结构及光感受器完整性。作者指出，多数PDE6B致病及可能致病变异通过功能缺失机制致病，因此优化基因补充可覆盖多数受累个体；目前尚无获批临床疗法。构建体采用标准AAV8而非工程化衣壳，理由是其已在眼内临床阶段载体中使用并具有较高光感受器转导效率；采用hGRK1启动子片段（?112至+183）驱动光感受器特异性表达，该启动子已在小鼠、犬、非人灵长类和人类光感受器中验证，并用于正在进行的RP基因治疗试验。PDE6B 3′UTR含经典AATAAA多聚腺苷化信号，转基因组转录本可能在该天然PDE6B序列背景下进行3′端加工，而不仅依赖异源bGH polyA信号；体外和体内筛选显示含3′UTR构建体PDE6B表达和挽救效果最佳。研究使用1.8×10
10 GC视网膜下递送，在rd10小鼠视网膜中耐受良好，未观察到结构损害。治疗眼视紫红质阳性视杆中表达PDE6B，且未出现cGMP蓄积，提示PDE6B蛋白在光转导中具有功能；视杆恢复伴随视锥死亡预防及视锥保存，视觉敏锐度和ERG改善与OCT及形态学变化一致。因单次视网膜下注射通常覆盖约三分之一视网膜，全视野ERG整合治疗和未治疗区域，故15个月时治疗眼暗视和明视b波幅度约为C57Bl/6对照的30–40%，可能低估转导区域内挽救程度。与既往rd1小鼠11个月、rd10小鼠6个月研究相比，该研究将rd10模型功能和结构监测延长至15个月，并使用标准AAV8、光感受器特异性启动子和PDE6B 3′UTR；长期验证很重要，因为IRD基因治疗临床研究曾报道患者在治疗后3年内视觉敏感度下降和光感受器恶化。研究还发现未治疗rd10视网膜中视杆双极细胞显著减少且形态紊乱，治疗眼PKCα阳性视杆双极细胞完整性维持，提示光感受器恢复可保存二级神经元。炎症方面，未治疗rd10视网膜Iba1阳性小胶质细胞增多并呈活化形态，GFAP在Müller胶质中升高，与光感受器萎缩区域一致；治疗眼15个月时小胶质细胞密度和Müller胶质活化降低，且未观察到载体长期不良炎症反应；4周时治疗和未治疗眼炎症标志均升高，与当时持续光感受器变性和注射操作影响一致。局限性包括：长期实验未纳入匹配的无3′UTR组，故不能将挽救持久性特异归因于3′UTR，也不能区分AAV2/8衣壳、GRK1启动子和3′UTR各自贡献；体内筛选比较为单一时间点，旨在选择构建体而非确定性比较；3′UTR增强表达的精确转录后机制未通过实验解析；单次视网膜下注射覆盖约三分之一视网膜使全视野ERG低估转导区挽救。作者认为需要匹配长期随访的头对头研究确定各元件对持久性的独立贡献。
研究结论翻译：本研究通过展示RP小鼠模型治疗后15个月持续功能挽救，满足长期基因治疗评估需求；证据包括治疗区域内视网膜细胞结构保存、cGMP水平正常、炎症降低，以及与治疗区域相符的光转导信号维持。该结果通过含PDE6B 3′UTR序列的优化AAV载体构建体实现，使人PDE6B在视杆光感受器中持续高效表达和转导。总之，研究人员的结果表明，这种优化的光感受器靶向构建体可在rd10视网膜中维持功能和结构挽救至少15个月，支持其进一步临床前开发。
