《Microbiological Research》：Pseudomonas aeruginosa MucP limits RNA phage propagation by targeting phage lysis
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摘要
裂解性噬菌体通过引发感染宿主细胞的裂解来完成其生命周期。尽管噬菌体介导的裂解机制已在分子水平上得到了广泛研究，但干扰裂解阶段的细菌机制仍知之甚少。在这里，我们发现铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA）中的位点2蛋白酶MucP能
摘要
裂解性噬菌体通过引发感染宿主细胞的裂解来完成其生命周期。尽管噬菌体介导的裂解机制已在分子水平上得到了广泛研究，但干扰裂解阶段的细菌机制仍知之甚少。在这里，我们发现铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA）中的位点2蛋白酶MucP能够削弱RNA噬菌体PP7裂解蛋白（LP）的活性，而LP含有跨膜（TM）螺旋结构，这表明MucP是一种阻碍PP7诱导裂解的细菌因子。我们通过P26L和S40L突变鉴定出了一种具有增强螺旋倾向的LP变体（LP*），该变体对MucP具有抗性，并且能够杀死对野生型LP具有抗性的PA菌株，从而揭示了MucP活性与LP易感性之间的负相关关系。携带LP*的PP7突变体表现出对MucP的逃避现象，无论MucP是否过量表达都能形成明显的菌斑，尽管其繁殖能力有所下降。总体而言，这些发现表明MucP通过重新利用宿主编码的蛋白酶来抑制噬菌体的裂解过程。
引言
噬菌体的生命周期通常包括五个 distinct 步骤：噬菌体吸附、基因组进入、物质合成、病毒颗粒组装以及噬菌体释放（Bae等人，2024a）。作为生命周期的最后阶段，所有噬菌体在病毒颗粒组装之后都会引发宿主细胞裂解，仅有丝状噬菌体会在不导致细胞裂解的情况下释放后代噬菌体（Young，2014；Hay和Lithgow，2019）。然而，宿主细胞裂解对于最大化噬菌体后代产量至关重要，因为裂解的时间决定了病毒颗粒组装与后代释放之间的平衡（Cahill和Young，2019）。因此，噬菌体捕食是塑造细菌种群的主要生态力量，有助于社区结构和细胞物质的释放，从而促进养分循环（Dennehy和Abedon，2021；Chevallereau等人，2022）。
噬菌体介导的细胞裂解对于噬菌体的最佳繁殖至关重要，因此裂解时机受到严格调控，这取决于噬菌体种类的复杂性。通常会产生两种关键的裂解蛋白（holins和endolysins）来促进细胞裂解（Young，2014）：holins是与细菌细胞质膜结合的膜蛋白，能够在膜上形成裂孔；而endolysins则是降解细菌肽聚糖的酶。在感染革兰氏阴性细菌的噬菌体中，spanins常作为第三种裂解成分，通过破坏内膜和外膜之间的连接来实现裂解（Summer等人，2007）。这种需要多种基因产物的裂解方式在大多数双链DNA噬菌体中得到利用。相比之下，一些体积较小的噬菌体（例如单链DNA或RNA噬菌体）仅含有一个负责细胞裂解的基因，这类噬菌体的研究相对较少，与目前已充分研究的多基因裂解系统相比（Chamakura和Young，2019；Chamakura等人，2020）。这些噬菌体被认为通过单基因裂解蛋白（Sgl）来释放后代，这些蛋白质含有跨膜（TM）螺旋结构，并与细胞膜结合，从而破坏细胞壁的生物合成（Rajaure等人，2015）。例如，已知RNA噬菌体如M、PP7和CJ3的Sgl蛋白能够抑制参与肽聚糖合成的细菌flippase MurJ（Chamakura等人，2017；Adler等人，2023；Li等人，2026）。
细胞裂解对噬菌体适应性的关键作用意味着这一过程需要精确调控，特别是对于携带Sgl蛋白的噬菌体。在这项研究中，我们重点关注了感染某些铜绿假单胞菌（PA）菌株（包括PAO1，Kim等人，2018；Bae等人，2025a）的PP7的Sgl（LP）。我们发现，膜嵌入的位点2锌金属蛋白酶MucP的功能障碍会增强宿主对PP7的敏感性，但不会影响对其他DNA噬菌体的敏感性。MucP能够促进MucA的蛋白水解，进而激活AlgU依赖性的包膜应激反应和黏液转化（Delgado等人，2018）。我们观察到MucP活性会破坏PP7的LP结构，这是由于TM螺旋中的低螺旋倾向残基（P26和S40）所致。在不同的PA临床分离株中，也观察到了MucP活性与LP易感性之间的负相关关系。此外，具有较高螺旋倾向突变的LP*（P26L和S40L）对MucP具有抗性，因此能够杀死高MucP活性的PA菌株，这表明MucP还起到减弱噬菌体介导的细胞裂解的作用。我们还研究了含有LP*的PP7（PP7*）的适应成本。
章节片段
PP7抗性菌株中不发生LP介导的细胞裂解
为了初步监测PA菌株中的LP介导的细胞裂解过程，借鉴之前在
大肠杆菌中对Sgl蛋白的研究（Winter和Gold，1983；Bernhardt等人，2000），我们开发了RNA噬菌体Sgl蛋白的可诱导表达系统。如图1A所示，我们使用
tac启动子来驱动Sgl基因在attTn7位点的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导下的表达（Peters和Craig，2001）。
讨论
噬菌体生物学中的一个基本问题是决定噬菌体宿主范围或宿主谱型的因素。这取决于噬菌体能否成功通过生命周期的各个阶段，并克服细菌在每个阶段所施加的抵抗或防御机制。我们的研究聚焦于小型RNA噬菌体（fiersphage）PP7的宿主范围的分子和亚分子决定因素，该噬菌体利用IV型菌毛（TFP）的II组菌毛蛋白作为其
细菌菌株和培养条件
铜绿假单胞菌（PAO1、PA14、PAK和PMM临床菌株）以及大肠杆菌（HB101、DH5α和SM10菌株）及其衍生物（表S1）在37°C的Luria-Bertani（LB）肉汤或含有2%琼脂的LB平板上培养（Acumedia）。使用Cetrimide琼脂（Difco）平板筛选铜绿假单胞菌（PA）菌株。必要时，添加以下浓度的抗生素（μg/ml）：PA的庆大霉素（50）和羧苄青霉素（200）；庆大霉素（25）
CRediT作者贡献声明
Hee-Won Bae：写作——审稿与编辑，撰写初稿，方法学研究，资金获取，数据分析，概念构思。 So-Yeon Kim：方法学研究，数据分析。 You-Hee Cho：写作——审稿与编辑，撰写初稿，项目管理，资金获取，数据分析，概念构思。 Se-Jeong Ahn：方法学研究，数据分析。 Hongbaek Cho：撰写初稿，数据分析。 Oh Hyun Kwon：方法学研究，数据分析。
致谢
本研究得到了韩国国家研究基金会（NRF）的资助（RS-2022-NR070540、RS-2022-NR067344和RS-2025-16069174）。
H.-W.B.和Y.-H.C.提出了研究方案并设计了实验。H.-W.B.、S.-Y.K.、S.-Y.C.、O.H.K.、H.-J.K.和S.-J.A.设计了实验并收集分析了数据。H.-W.B.和H.C.撰写了手稿。所有作者都参与了手稿的审稿。
