基于干血斑（DBS）-液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）法的13种双酚类化合物综合生物监测优化微量方法研究

《Microchemical Journal》：Towards comprehensive biomonitoring of bisphenols: An optimized micro-method based on DBS-LC-MS/MS approach for analysis of 13 bisphenols

摘要：双酚类化合物（BPs）是一组广泛用于聚碳酸酯塑料和环氧树脂生产的合成有机化合物。其中，双酚A（BPA）因其在食品容器、水瓶和热敏纸等消费品中的普遍存在而受到最广泛的研究。近年来，越来越多的证据表明，BPs不仅在环境中无处不在，而且在人体生物体液（包括血液、尿液和母乳）中也可检测到。BPs被公认为内分泌干扰化学物（EDCs），能够模拟或干扰天然激素信号传导。研究表明，BP暴露与多种不良健康结局相关，包括代谢紊乱、心血管疾病、生殖功能障碍和某些类型的激素依赖性癌症。2025年，欧盟法规(EU) 2024/3190禁止在所有预期与食品接触的材料（包括容器和器具）中使用BPA。因此，其他BPs如双酚S（BPS）或双酚F（BPF）正被用作“不含BPA”产品中BPA的替代品。然而，尽管对BPA进行了广泛研究，但其类似物的影响和流行情况仍知之甚少。本研究旨在开发并验证一种基于干血斑（DBS）结合液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）法同时测定13种BPs的高灵敏度、稳健分析方法。该研究首次将DBS用于分析大量游离和结合形式的BP类似物。该方法利用了微量取样（μ-sampling）的小型化规模（低溶剂消耗）和DBS相较于静脉穿刺提供的非侵入性方法。此外，研究还着重优化了超声辅助的微型QuEChERS（μ-QuEChERS）提取程序，以最大化极性和非极性类似物的回收率。最终，该方法被应用于166份真实样本的分析，以评估这些内分泌干扰物在人群中的流行率和分布。结果表明，BPA、BPS和双酚C（BPC）是检出率最高的化合物，且BPS和BPC在多个样本中达到了显著浓度水平。该研究为基于DBS的内分泌干扰物分析提供了有意义的进展，为评估人类对双酚类及其新兴类似物的暴露提供了一种灵敏、高效且微创的替代方案。

1. 研究背景与意义

双酚类化合物（BPs）作为一类重要的内分泌干扰化学物（EDCs），广泛应用于聚碳酸酯塑料和环氧树脂的生产。其中，双酚A（BPA）因其在食品接触材料中的广泛使用而备受关注。然而，随着欧盟法规(EU) 2024/3190对BPA使用的禁令生效，其结构类似物如双酚S（BPS）、双酚F（BPF）等作为替代品被越来越多地引入市场，这被称为“遗憾的替代”（regrettable substitution）。尽管对BPA的研究较为深入，但这些新兴类似物的暴露水平、体内分布及潜在毒性效应尚不明确。传统的人体生物监测多依赖尿液或静脉血样本。尿液虽采集简便，但仅反映近期暴露且易受水合状态影响；静脉血虽能提供更准确的全身内剂量信息，但采集过程具有侵入性，需要专业医疗人员及复杂的冷链运输存储条件。为解决上述问题，干血斑（DBS）采样技术作为一种微创、便捷、稳定的替代方案应运而生。然而，此前仅有少数研究将DBS应用于BPs分析，且仅限于单一BPA的检测。因此，开发一种能够同时、高灵敏度测定多种BPs（包括游离态和结合态）的DBS分析方法，对于全面评估人群的BP暴露风险、指导监管政策具有重要意义。

2. 研究内容与主要结论

研究人员成功开发并验证了一种基于DBS采样的超高效液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析方法，用于同时测定人体血液中13种BPs及其结合代谢物。该方法首次将DBS技术扩展至多种BP类似物的综合分析，并结合了优化的酶解脱共轭步骤，实现了对总BP暴露水平的准确评估。通过对西班牙阿尔梅里亚地区166份匿名志愿者DBS样本的实际应用分析，研究发现BPA、BPS和双酚C（BPC）是检出率最高且浓度水平最显著的三种污染物。值得注意的是，BPS和BPC在部分样本中的浓度甚至超过了BPA，这证实了“遗憾的替代”现象的存在，即受管制化学品被同样具有内分泌干扰潜力的结构类似物所取代。此外，研究还发现大部分检出的BPs以结合态（葡萄糖醛酸苷或硫酸盐结合物）形式存在，凸显了在生物监测中加入脱共轭步骤以避免低估内暴露量的必要性。该工作为大规模、微创的人体内分泌干扰物生物监测提供了可靠的工具和方法学基础。

3. 关键技术方法

为开展此项研究，研究人员采用了以下关键技术方法：

• •
  样本采集与制备：采用指尖毛细血管采血，使用校准毛细管精确转移50 μL血液至Whatman 903蛋白保存卡制备DBS样本。样本采集于西班牙阿尔梅里亚，包含116份匿名个体样本及50份由Hospital Universitario Torrecárdenas提供的样本。
• •
  样品前处理：开发了优化的微型QuEChERS（μ-QuEChERS）提取流程。首先，对DBS样本进行超声辅助萃取，以提高疏水性较强的BPs（如BPFL、BPG等）的回收率。随后，加入β-葡萄糖醛酸苷酶（来源于Helix pomatia）进行酶解脱共轭，并在甲醇辅助下实现超过80%的转化效率，有效释放结合态的BPs。
• •
  仪器分析：使用配备ACE C18-PFP色谱柱的Agilent 1290 Infinity RRLC液相色谱系统和Agilent 6460 A三重四极杆质谱仪，在电喷雾负离子模式（ESI-）下进行检测。流动相中添加0.5 mM氟化铵（NH₄F）显著提高了弱酸性BPs的电离效率和检测灵敏度。
• •
  方法验证与质量控制：依据ICH M10指南对方法的选择性、线性、基质效应（ME）、定量限（LOQ/LOD）、准确度、精密度、稳健性、稳定性和残留效应进行了全面验证。采用基质匹配校准曲线进行定量以补偿严重的基质抑制效应，并通过严格的质量控制措施（如程序空白、溶剂空白、重复分析）确保数据可靠性。

4. 研究结果

3.1 LC-QqQ-MS优化

通过比较不同流动相添加剂（甲酸、乙酸铵缓冲液、氟化铵），发现0.5 mM氟化铵能显著提高BPs在负离子模式下的电离效率。在色谱柱筛选中，ACE EXCEL PFP色谱柱相比Zorbax Eclipse Plus C18和Hypersild Gold aQ柱提供了更高且更尖锐的色谱峰。最佳进样体积为10 μL，平衡了灵敏度和峰形。

3.2 提取方法优化

对比了原始QuEChERS和AOAC QuEChERS两种方法，原始QuEChERS获得了更高的回收率和更低的基质效应。为改善疏水性BP类似物（log K_ow > 5）的低回收率问题，引入了超声辅助萃取步骤，使这些化合物的回收率得到显著提升。最终确定采用原始QuEChERS结合超声探头的方案。

3.2.1 脱共轭步骤优化

使用BPA-葡萄糖醛酸苷和BPA-硫酸盐标准品评估脱共轭效率。增加酶用量（至120,000 units/mL血液）和延长孵育时间（12小时）后，效率仍低于60%。加入少量甲醇后，脱共轭效率提升至86%（葡萄糖醛酸苷）和82%（硫酸盐），表明甲醇有助于防止酶解条件下BP分子的水解。

3.3 血细胞比容（Hct）影响评估

通过调整血液样本的Hct值（25%-65%）发现，Hct对提取回收率和基质效应均有化合物依赖性影响。回收率在Hct 25%时最高，在45-65%范围内趋于稳定。基质抑制效应在低Hct时更为严重。研究采用固定血量和全斑点提取策略，并使用混合全血样本进行验证，以最小化Hct差异带来的影响。

3.4 方法验证与质控/保证

方法验证结果显示，基质匹配校准曲线的决定系数（R²）均大于0.98。所有目标分析物均表现出显著的基质抑制效应（ME范围：-65%至-89%）。最低定量限（LLOQ）范围为0.25-2.5 μg/L。大多数化合物的日内和日间准确度（回收率）和精密度（RSD）在可接受范围内。部分疏水性化合物（如BPFL、BPG等）回收率较低（50-70%），但在定量时通过校正因子进行补偿。稳定性、稳健性和残留效应评估均符合要求。

3.5 样本分析

对166份DBS样本的总BP（经脱共轭处理）和游离BP进行分析。BPA、BPS和BPC是最主要的污染物，检出频率分别为84%、62%和12%。BPA总浓度范围为

5. 总结与结论

讨论部分指出，本研究中观察到的BPS和BPC高浓度水平，远高于既往文献报道的普通人群血清/血液中的浓度，这可能与研究人群特征、暴露源差异或对结合态物种的分析覆盖有关。研究强调了同时定量多种BP类似物及其结合形态的重要性，并指出了进一步调查高污染来源的必要性。

研究结论：本研究提出了一套基于DBS微量取样的综合性、优化分析流程，用于同时测定人血中13种BPs（包括游离和结合形式）。该方法结合了小型化QuEChERS提取、超声辅助萃取和优化的酶解脱共轭步骤，仅需少量毛细血管血即可获得满意的分析性能。与以往仅限单一BPA分析的DBS方法相比，该方法显著扩展了分析覆盖范围并提升了整体性能。对166份人体样本的成功应用进一步证实了该方法的稳健性和在大规模生物监测研究中的适用性。BPA、BPS和BPC是检出率最高的化合物，且相当比例的BPs以结合形式存在，这支持了在评估内暴露量时必须纳入脱共轭步骤的观点。此外，多种BPA替代品的检出强化了将生物监测范围扩展到BPA之外的必要性。总体而言，这项工作为基于DBS的内分泌干扰物分析提供了有意义的进步，为评估人类对双酚类及其新兴类似物的暴露提供了一种灵敏、高效且微创的替代方案。