SlHYL1-SlRBP1模块整合赤霉素代谢促进番茄（*Solanum lycopersicum*）株高

《The Plant Journal》：The SlHYL1-SlRBP1 module integrates gibberellin metabolism to promote plant height in tomato (Solanum lycopersicum)

株高是显著影响作物产量与品质的重要农艺性状。HYPONASTIC LEAVES 1（HYL1）作为microRNA（miRNA）生物合成的核心组分，其在番茄（*Solanum lycopersicum*, Sl）农艺性状中的调控机制仍知之甚少。本研究中，研究人员证实CRISPR/Cas9介导的Sl_HYL1敲除导致矮化；通过RNA干扰（RNAi）在番茄品种“Ailsa Craig”（AC）中部分抑制Sl_HYL1，可增加节间数但降低节间长度，产生半矮化表型，从而确认Sl_HYL1在调控株高中的作用。细胞学分析显示，Sl_HYL1抑制同时减少了节间内的细胞数目和细胞大小。酵母双杂交筛选发现，Sl_HYL1与另一种番茄RNA结合蛋白1（Sl_RBP1）互作。敲低Sl_RBP1表现出与Sl_HYL1-RNAi类似的半矮化表型。进一步研究表明，Sl_HYL1-Sl_RBP1模块加性地促进赤霉素（GA）生物合成基因的表达，从而促进GA积累。此外，外源GA₃处理可部分恢复Sl_HYL1-RNAi和Sl_RBP1-RNAi植株的矮化表型。值得注意的是，与Sl_HYL1不同，Sl_RBP1不影响大多数miRNA的生物合成。综上所述，研究结果表明Sl_HYL1-Sl_RBP1模块通过增强GA积累来调控番茄株高。

株高是决定番茄产量和品质的重要农艺性状，赤霉素（gibberellin, GA）在其中发挥核心调控作用。HYL1作为microRNA（miRNA）生物合成的核心组分，其在番茄株高调控中的功能与机制长期不清楚。本研究以栽培番茄品种“Ailsa Craig”（AC）为材料，旨在阐明Sl_HYL1及其互作蛋白Sl_RBP1调控株高的分子途径。

研究人员首先通过CRISPR/Cas9敲除Sl_HYL1，获得严重矮化且叶片极性异常的突变体；由于突变体不能产生后代，又利用RNA干扰（RNA interference, RNAi）在AC背景中部分抑制Sl_HYL1，得到节间数增加但节间长度减短的半矮化株系，而Sl_HYL1过表达未改变株高。细胞学切片显示，Sl_HYL1抑制同时降低节间细胞长度、宽度及数目。酵母双杂交（yeast two-hybrid, Y2H）筛选发现Sl_HYL1与Sl_RBP1互作，并通过双分子荧光互补（bimolecular fluorescence complementation, BiFC）、免疫共沉淀（co-immunoprecipitation, Co-IP）和GST pull-down验证。Sl_RBP1-RNAi株系呈现与Sl_HYL1-RNAi相似的半矮化表型，且两者不互相调控转录。转录组比较显示两者共同调控1253个基因；与Sl_HYL1-RNAi相比，Sl_RBP1-RNAi对大多数pri-miRNA和成熟miRNA丰度影响很小，提示Sl_RBP1主要不依赖经典miRNA途径。进一步研究发现，Sl_HYL1-Sl_RBP1模块加性上调GA合成关键基因SlCPS和SlKAO，同时影响其他GA代谢基因，导致内源GA₁、GA₃、GA₄和GA₉含量显著降低；外源GA₃可部分恢复矮化表型。双RNAi株系比单RNAi株系更矮，且SlCPS、SlKAO等GA代谢基因表达进一步下降，证明Sl_HYL1与Sl_RBP1加性调控GA合成。在GA缺陷突变体gib3中，Sl_HYL1与Sl_RBP1表达下降，提示该模块与GA代谢形成正反馈。双荧光素酶实验表明，Sl_HYL1-Sl_RBP1对SlCPS和SlKAO的调控是间接的。

研究采用的关键技术包括：CRISPR/Cas9基因编辑与RNAi/过表达转基因技术（材料为番茄AC背景）；石蜡切片与显微观察分析细胞大小和数目；Y2H、BiFC、Co-IP、GST pull-down验证蛋白互作；转录组测序（RNA-seq，样品为14日龄AC、Sl_HYL1-RNAi-17#和Sl_RBP1-RNAi-8#的茎尖）；液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）测定内源GA含量；外源GA₃喷施恢复实验；双荧光素酶瞬时表达系统检测SlCPS和SlKAO启动子响应。

研究结果如下：

1. SlHYL1在多种组织中普遍表达并响应外源激素。qRT-PCR显示Sl_HYL1在根、茎、茎尖、叶、花和果实中均表达，花和果实中最高；外源GA₃处理可瞬时上调Sl_HYL1表达，IAA和KT处理则轻微下调。亚细胞定位显示Sl_HYL1定位于细胞核和细胞质。

2. 部分抑制SlHYL1导致半矮化。Sl_HYL1敲除突变体严重矮化，株高约5 cm，且叶片极性丧失；Sl_HYL1-RNAi株系节间明显缩短但节间数增加，半矮化；过表达株系无显著表型。切片分析表明，Sl_HYL1抑制使节间细胞长度、宽度和数目均显著下降。

3. SlHYL1与SlRBP1发生物理互作。Y2H显示全长Sl_HYL1及其C端片段与Sl_RBP1互作；BiFC证实互作发生在细胞核；Co-IP和GST pull-down进一步验证了体内外互作。

4. SlRBP1敲低类似SlHYL1-RNAi表型。Sl_RBP1-RNAi株系株高降低、节间缩短但节间数增加，细胞大小和数目也减少；Sl_HYL1与Sl_RBP1在转录水平互不调控。

5. 转录组比较显示SlHYL1与SlRBP1处于同一通路。二者共同调控1253个基因，其中98.96%的共调控基因变化方向一致；细胞周期相关基因（Cyclins、CDPKs、KRPs）和细胞扩张相关基因（Expansins）普遍下调。Sl_RBP1对miRNA生物合成影响很小，而Sl_HYL1影响多个pri-miRNA和成熟miRNA水平。

6. 外源GA处理可恢复半矮化表型。Sl_HYL1-RNAi和Sl_RBP1-RNAi中GA合成基因SlCPS和SlKAO显著下调，内源GA含量降低；100 μM GA₃喷施可显著恢复株高。

7. SlHYL1和SlRBP1加性调控株高。双RNAi株系比任一单RNAi亲本更矮，节间长度进一步缩短，SlCPS、SlKAO、SlGA20ox3和SlGA3ox2等GA代谢基因表达进一步降低；双荧光素酶实验表明该调控为间接作用，且与GA状态形成正反馈。

讨论部分总结指出，Sl_HYL1-Sl_RBP1模块通过促进GA积累增强茎细胞伸长和增殖，从而正向调控番茄株高；Sl_RBP1对株高的调控基本不依赖经典miRNA生物合成途径。该工作揭示了RNA结合蛋白与GA代谢之间的新联系，为番茄株型调控网络提供了新见解。研究结论为：Sl_HYL1-Sl_RBP1模块通过加性上调SlCPS和SlKAO表达促进GA生物合成，进而正向调控番茄株高；Sl_RBP1介导的株高调控不依赖经典miRNA生物合成途径。