细胞周期蛋白G相关激酶（GAK）激酶活性作为弥漫性大B细胞淋巴瘤有丝分裂的肿瘤选择性可临床转化靶点：表型筛选与机器学习靶点反卷积研究

《Leukemia》：The cyclin-G associated kinase (GAK) is a clinically actionable drug target required for mitosis in diffuse large B-cell lymphoma

　　

摘要：尽管已有100种激酶抑制剂获批临床使用，但基因组中大多数激酶仍表征不足。此外，尽管激酶抑制剂已革新部分癌症的治疗，但多数其他癌症对这些通常靶向信号转导通路的药物仅短暂应答或无应答。鉴于细胞调控的每一步均受磷酸化事件影响，研究人员假设表型筛选和机器学习分析可揭示新的激酶靶点。弥漫性大B细胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL）是最常见淋巴瘤，对信号转导导向的激酶抑制剂应答不佳。研究人员将一组探针应用于广泛代表DLBCL致病异质性的系统，并对结果进行以肿瘤选择性为目标的迭代靶点反卷积分析（iterative target-deconvolution analysis aimed at tumor selectivity，idTRAX）。这些努力鉴定细胞周期蛋白G相关激酶（cyclin-G-associated kinase，GAK）为肿瘤选择性靶点。机制研究表明GAK激酶活性是有丝分裂进展所必需，抑制其活性导致G₂/M期阻滞和细胞死亡，并在视网膜母细胞瘤（retinoblastoma，RB）肿瘤抑制因子缺失时疗效增强。GAK导向的激酶抑制剂，包括药物重定位的临床化合物，在in vivo中显示出有前景的单药抗DLBCL活性。因此，GAK激酶功能是可靶向的依赖，为快速临床转化开辟新的治疗策略。此外，研究人员确立带靶点反卷积的表型筛选作为揭示肿瘤选择性激酶依赖的通用策略。

论文解读文章：

研究背景：DLBCL是最常见血液系统恶性肿瘤之一，临床和分子高度异质。基因表达谱曾将其分为生发中心B细胞（germinal center B-cell，GCB）和活化B细胞（activated B-cell，ABC）来源亚型，ABC预后较差；后续基因组学研究又定义5–7个分子亚组。尽管疾病生物学认识增加，针对特定分子亚型的干预进展有限，R-CHOP仍为无论分子特征的标准一线治疗；pola-R-CHP改善无进展生存但未改善总生存，30–40%患者不能治愈。CD19导向嵌合抗原受体T细胞（chimeric antigen receptor T cells，CAR-T）是潜在一线挽救选择，但资源密集且仅三分之一或更少患者治愈。BTK抑制剂革新其他B细胞淋巴瘤治疗，却在DLBCL作用有限；ViPOR组合有前景但长期缓解未明且未入指南。已批准激酶抑制剂仅针对25种激酶，不足激酶组5%，而磷酸化事件众多、功能多不明确。因此，研究人员以表型筛选和机器学习靶点反卷积寻找能克服DLBCL异质性的肿瘤选择性激酶依赖。

研究人员针对490种激酶抑制剂在代表GCB和ABC的DLBCL细胞系及外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMC）中筛选，经idTRAX鉴定GAK为新型肿瘤选择性候选靶点，并用RNA干扰、CRISPR和化学抑制验证。研究得出GAK激酶活性参与有丝分裂，抑制后引起纺锤体异常、纺锤体组装检查点（spindle assembly checkpoint，SAC）激活、G₂/M阻滞和细胞死亡，RB缺失时敏感性增强；多种临床激酶抑制剂具抗GAK活性，OTS167在DLBCL患者来源异种移植（patient-derived xenograft，PDX）模型中有效。该研究将GAK确立为可靶向依赖，并提供药物重定位的快速转化路径及通用靶点发现策略。

关键技术方法：研究人员用PKIS-I、PKIS-II和KCGS库的490种激酶抑制剂对6株GCB和4株ABC DLBCL细胞系及PBMC作表型筛选，计算药物敏感性评分（drug sensitivity score，DSS）和差异DSS（differential DSS，dDSS），整合已发表激酶活性谱与idTRAX算法进行靶点反卷积；以siRNA、诱导型CRISPR-Cas9竞争实验和公共CRISPR依赖数据验证；用RNA-seq、流式细胞周期/凋亡、免疫印迹、共聚焦免疫荧光和活细胞成像解析表型；用NanoBRET检测细胞内靶点结合；在NSG小鼠U2932尾静脉模型和GCB DLBCL PDX 75549R2中评估体内疗效；并分析Lenz et al.（n=414）、Reddy et al.（n=775）和泛癌全基因组分析（Pan-Cancer Analysis of Whole Genomes，PCAWG；n=75）DLBCL基因表达队列。

研究结果：
1. 表型筛选将GAK鉴定为DLBCL新型候选药物靶点：通过490种抑制剂对10株DLBCL和PBMC筛选、DSS/dDSS计算及idTRAX反卷积，AURKA作为已知靶点被复现，GAK作为新候选出现；siRNA、诱导型CRISPR-Cas9竞争实验和公共CRISPR数据均显示GAK缺失降低DLBCL存活，SGC-GAK-1选择性杀伤而GAK保留类似物SGC-GAK-1N无效，支持GAK依赖性。
2. GAK抑制对DLBCL广泛活跃，且对B细胞受体信号或内化无一致影响：通过大panel生长抑制实验，SGC-GAK-1的GI50≤1 μM，ABC来源细胞系总体更敏感；α-IgM刺激后免疫印迹显示BTK、AKT、ERK磷酸化未显著改变；流式检测B细胞受体（B-cell receptor，BCR）内化和转铁蛋白摄取显示GAK抑制不影响内吞，而dynasore抑制内吞，提示抗DLBCL活性不主要经BCR信号或网格蛋白介导内吞（clathrin-mediated endocytosis，CME）。
3. GAK抑制激活纺锤体组装检查点基因表达反应：通过U2932和Ly1细胞12、24 h RNA-seq及FGSEA，GAK抑制上调细胞周期和SAC相关基因，包括BUB1、BUB1B、CCNB1、AURKB、PLK1；Lenz et al.、Reddy et al.和PCAWG患者基因表达数据中，GAK高表达病例富集于有丝分裂和囊泡运输相关基因集，尤其MITOTIC_SPINDLE_ASSEMBLY。
4. GAK抑制触发有丝分裂纺锤体组装检查点诱导和G₂/M期细胞周期阻滞：通过免疫印迹，SGC-GAK-1升高BUB1B、BUB1、Cyclin B1和pH3，类似vincristine；流式DNA含量分析显示G₂/M积累；共聚焦免疫荧光显示纺锤体扭曲、染色体错排和多星体；Annexin V/碘化丙啶显示凋亡增加；小鼠骨髓集落形成单位（colony-forming unit，CFU）实验中SGC-GAK-1不影响而alisertib显著抑制，提示肿瘤选择性有丝分裂依赖。
5. 视网膜母细胞瘤缺陷增加对GAK抑制有丝分裂破坏的敏感性：通过Lenz et al.和Reddy et al.队列分析，低RB1表达与高GAK表达相关；RB缺失的RIVA和U2932细胞G₂/M阻滞最显著；U2OS RB1^?/?细胞中pH3诱导增强，活细胞成像显示RB缺失细胞更向细胞毒状态偏移，提示RB功能状态与GAK抑制敏感性相关。
6. 多种临床激酶抑制剂对GAK强效，突显临床可操作性和快速转化路径：通过NanoBRET细胞内靶点结合实验，OTS167、milciclib、bosutinib、gilteritinib、fedratinib对GAK的胞内效力高于SGC-GAK-1；milciclib和OTS167抑制DLBCL生长并诱导pH3和G₂/M阻滞，支持现有临床药物重定位。
7. 临床阶段OTS167在DLBCL PDX模型中显示体内疗效：通过GCB DLBCL PDX 75549R2皮下NSG小鼠模型，OTS167单药口服显著降低肿瘤体积，总生存p=0.06、终点瘤重p=0.09，免疫组化显示pH3增加、Ki67降低；高选择性MELK抑制剂NVS-MELK8a无显著生长抑制，公共CRISPR数据亦不支持MELK依赖，支持OTS167抗淋巴瘤活性与GAK抑制相关并值得进一步研究。

讨论部分总结：讨论指出，GAK在DLBCL中与有丝分裂基因程序激活及RB1缺陷相关；GAK激酶抑制主要造成有丝分裂破坏，而非显著影响内吞和BCR运输；RB缺失细胞效应更快更强，为候选生物标志；ABC来源细胞系虽略敏感，但RB功能状态是更强相关因素。作者也指出局限：SGC-GAK-1药代动力学差，需ABT提高暴露，系统U2932实验应视为概念验证；OTS167仅在单一GCB来源PDX中验证；两项体内研究均用免疫缺陷NSG小鼠，未评估完整免疫系统；未进行剂量范围药代/药效研究，磷酸化底物待磷酸蛋白组学；RB同源验证仅限U2OS，DLBCL背景RB1敲除未成功，RB缺陷与敏感性增强在DLBCL中仍为相关性。研究结论部分翻译：总体而言，本研究将GAK定义为DLBCL中新型且可靶向的依赖，为靶向治疗开发开辟新途径；临床激酶抑制剂对GAK的频繁脱靶抑制，包括数种已获批药物，进一步支持将抑制GAK作为治疗策略的可行性和安全性；未来研究将继续探索GAK在DLBCL发病机制中作用的分子机制，尤其是其调控有丝分裂的具体磷酸化底物，并阐明GAK抑制对癌症生物学的更广泛影响；这些努力将加深对DLBCL的理解，并促进针对这一侵袭性恶性肿瘤开发更有效的靶向治疗；总体而言，研究人员设计并验证了表型筛选和计算靶点反卷积，以突破尚未在癌症治疗中被靶向的95%人类激酶；随着激酶导向化合物库扩展其靶点谱和详细注释，该方法有望进一步将新靶点带入癌症临床；该策略的一个决定性优势是能够揭示既具肿瘤选择性又在分子亚型间有活性的靶点，正如GAK在GCB和ABC DLBCL中，以及额外血液和实体瘤细胞系的广泛敏感性进一步提示的那样，直接应对了困扰DLBCL单靶点激酶治疗的异质性。