《Materials Today Communications》：Chitosan-Based miR-675 Nanocarriers Immobilized on Polycaprolactone/Silk Fibroin Nanofibers for Enhanced Odontogenic Differentiation
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负载miR-675的壳聚糖纳米颗粒（CSNPs）固定于聚己内酯/丝素蛋白（PCL/SF）支架，可增强牙髓干细胞（DPSCs）成牙向分化；聚多巴胺（PD）可实现pH调控的CSNPs固定，并保持支架孔隙率；将CSNPs引入类细胞外基质（ECM）的PCL/SF支架，
负载miR-675的壳聚糖纳米颗粒（CSNPs）固定于聚己内酯/丝素蛋白（PCL/SF）支架，可增强牙髓干细胞（DPSCs）成牙向分化；聚多巴胺（PD）可实现pH调控的CSNPs固定，并保持支架孔隙率；将CSNPs引入类细胞外基质（ECM）的PCL/SF支架，可协同调控DPSCs命运。
研究背景：牙髓再生对创伤、深龋或牙髓病后恢复牙齿活力和功能具有重要意义。牙髓干细胞（DPSCs，dental pulp stem cells）具自我更新和多向分化潜能，但高效定向其成牙向分化仍需能提供生化与结构信号的生物材料。微小RNA-675（miR-675，microRNA-675）被报道可促进DPSCs成骨/成牙向分化，并可能通过表观遗传调控DLX3发挥成牙作用；但miRNA不稳定、易酶解、细胞摄取差，需要保护并持续靶向释放。壳聚糖（CS，chitosan）因生物相容性、可降解性和核酸结合能力成为递送载体；壳聚糖纳米颗粒（CSNPs，chitosan nanoparticles）可保护核酸并促内体逃逸。聚己内酯（PCL，polycaprolactone）力学性能好但疏水，丝素蛋白（SF，silk fibroin）可改善亲水性和生物活性，二者复合的PCL/SF纤维可模拟细胞外基质（ECM，extracellular matrix）。已有miR-222/CSNPs结合SF支架促神经分化，本研究改为miR-675并针对DPSCs成牙向分化，采用pH调控沉积策略，将miR-675/CSNPs固定于聚多巴胺（PD，polydopamine）修饰的PCL/SF纳米纤维，并系统关联结构特征与成牙标志表达，以解决miRNA递送与支架协同信号问题。研究人员制备并表征该复合支架、纳米粒及释放行为，并在体外评价DPSCs粘附、增殖和成牙向分化；结果支持该平台通过CSNPs介导的miR-675递送与ECM样纳米纤维拓扑协同促进DPSCs成牙向分化及矿化，为牙髓-牙本质复合体再生提供候选策略，但仍需体内验证。
关键技术方法：制备再生SF；以不同PCL:SF比例静电纺丝制备PCL/SF纳米纤维，并以扫描电镜（SEM，scanning electron microscopy）、X射线衍射（XRD，X-ray diffraction）、傅里叶变换红外光谱（FTIR，Fourier-transform infrared spectroscopy）、水接触角（WCA，water contact angle）和拉伸测试筛选70:30支架；通过多巴胺碱性溶液氧化聚合形成PD涂层；采用离子凝胶法，以不同CS:三聚磷酸钠（TPP，tripolyphosphate）和CS:miRNA质量比制备miR-675/CSNPs，并用动态光散射（DLS，dynamic light scattering）、透射电镜（TEM，transmission electron microscopy）和琼脂糖凝胶电泳表征；在不同pH下将CSNPs沉积于PD-PCL/SF并检测释放；采用DPSCs进行MTT（细胞活力检测）、流式、免疫荧光、SEM、碱性磷酸酶（ALP，alkaline phosphatase）、茜素红S（ARS，Alizarin Red S）和Western blot评价。样本队列来源原文未注明；DPSCs实验经Tabriz University of Medical Sciences伦理委员会批准（IR.TBZMED.REC.1401.271）。
研究结果：
3.1 丝素蛋白表征：FTIR检测再生SF，显示酰胺I–III等相关峰，提示β-sheet-rich有序蛋白结构，支持机械稳定和支架制备。
3.2 PCL/SF纳米纤维支架表征
3.2.1 支架形貌：SEM显示各比例均形成连续无珠纤维；SF增加使均匀性下降、直径分布变宽，平均直径分别为97.2、104.9、118.0、144.9和102.1 nm；70:30直径最大且纤维结构更开放，故选。
3.2.2 XRD分析：PCL在2θ=21.45°和24.43°显示(110)、(200)晶峰；SF约19°的结晶贡献不明显，可能以弱结晶或部分有序β-sheet存在。
3.2.3 FTIR分析：PCL/SF谱除PCL羟基、C-H和羰基酯峰外，出现SF酰胺I–IV相关峰，支持复合。
3.2.4 水接触角：SF含量增加使WCA由115.1°（100:0）降至59.8°（60:40），70:30为63.1°，亲水性提高，预期利于DPSCs粘附铺展。
3.2.5 力学性能：随SF增加杨氏模量升高，70:30最高（128.32±51.55 MPa），断裂伸长率降至22.41±5.35%；80:20拉伸强度最高（21.05±9.38 MPa），中间比例兼顾刚度、强度和柔性。
3.3 PD涂层PCL/SF支架表征
3.3.1 SEM图像：PD涂层保持三维连续纤维结构，平均直径约75 nm，纤维表面略粗糙，提示形成薄层。
3.3.2 PD-PCL/SF的XRD：PCL特征峰仍可见，PD无定形贡献约22°增加基线但无新尖峰，提示PD薄层不显著改变本体结晶。
3.3.3 PD-PCL/SF的水接触角：70:30支架WCA由63.1°降至60.1°，亲水性略增。
3.3.4 PD-PCL/SF的FTIR：出现O-H/N-H宽峰及PD芳香/胺相关振动，PCL酯羰基峰仍可见，支持PD存在。
3.4 miR-675/CSNPs表征
3.4.1 粒径和zeta电位：CS:TPP由10:1至2:1使直径由52.9增至155.5 nm；CS溶液zeta为+36.7 mV，TPP使zeta下降；多分散指数（PDI，polydispersity index）<0.3；选CS:TPP 5:1（65.1 nm，+23.5 mV），载miR-675后直径约60 nm、zeta约+15 mV，提示有效静电复合且无聚集，有利胶体稳定、细胞膜相互作用和内体逃逸。
3.4.2 凝胶阻滞：游离miR-675有迁移带，各CS:miRNA比例复合物无可见迁移带；200:1至96 h仍无迁移带，提示结合并滞留。
3.4.3 TEM：纳米粒主要呈球形，直径约60-70 nm，利于细胞内化。
3.4.4 miR-675/CSNPs的生物相容性：MTT显示50-300 nM在24 h无显著差异，48 h 200/300 nM促增殖，96 h均高于对照且200 nM最高；免疫荧光示细胞铺展和骨架良好，支持后续选用200-300 nM。
3.4.5 细胞摄取：流式显示6 h时69.0%细胞FAM（羧基荧光素）阳性（PEI介导94.2%，未染1.02%）；荧光图像确认内化，归因于正电荷、<100 nm粒径和>+15 mV zeta电位。
3.5 CSNPs在PD-PCL/SF支架上的涂层：SEM显示pH影响分布；pH 5.0时胺基质子化、颗粒间排斥，分布更均匀且保留纤维间孔；pH 7.0和8.5时去质子化、聚集和溶解度下降，形成不规则堵孔涂层，堵孔不利营养运输和细胞进入。
3.6 释放实验：FAM标记miR-675从支架累积释放24 h约22.4%，168 h约32%，240 h约33%，呈初期释放后趋缓。
3.7 支架对DPSCs行为的影响：SEM示细胞粘附并浸润各支架，CSNPs/PD-PCL/SF和miR-675/CSNPs/PD-PCL/SF组铺展和丝状伪足更明显；DAPI（核染料）/phalloidin示两CSNPs组纤维状肌动蛋白（F-actin，filamentous actin）荧光高于PCL/SF，miR-675加载未额外显著增加F-actin；MTT示各支架支持存活，PD-PCL/SF高于PCL/SF，CSNPs/PD-PCL/SF略低但无显著差异，最终支架最高，提示CSNPs与miR-675提供额外促增殖信号。
3.8 支架对DPSCs分化的影响：ALP活性在除PCL/SF外各组高于对照，CSNPs增加ALP，miR-675加载较CSNPs/PD-PCL/SF进一步增加，最终支架最高；ARS示miR-675/CSNPs增强钙沉积，最终支架矿化最高且显著高于CSNPs/PD-PCL/SF，PCL/SF对钙沉积无显著作用；Western blot示对照和PCL/SF组成牙蛋白COL-1（I型胶原，type I collagen）、DSPP（牙本质涎磷蛋白，dentin sialophosphoprotein）、DMP-1（牙本质基质蛋白-1，dentin matrix protein-1）、RUNX-2（runt相关转录因子2）和ALP低而相近，CSNPs/PD-PCL/SF未明显提高，可溶性miR-675/CSNPs提高全部标志，固定在支架上进一步最高。原文指出未设PD-PCL/SF单独对照，不能区分PD独立贡献。
讨论部分总结：该支架的优越表现提示生化与生物物理信号协同：支架提供ECM样刚度、纤维直径和亲水性以利DPSCs粘附铺展，PD锚定CSNPs在材料-细胞界面提供局部持续miR-675释放，可能较瞬时纳米粒暴露更持久维持细胞内miR-675水平，从而协调上调成牙标志和矿化。原文也指出局限：未设PD-PCL/SF单独对照，不能区分PD独立贡献；未评估支架体内降解、组织相容性和促进修复性牙本质形成能力；膜状形式适合直接盖髓和活髓切断等活髓治疗，未来应在活髓治疗模型及更广泛牙髓再生中评价。
研究结论翻译：将miR-675/CSNPs整合入PCL/SF纳米纤维支架形成生物活性系统，为DPSCs向成牙本质细胞样表型分化提供有利微环境。miR-675/CSNPs/PD-PCL/SF支架显示更优的细胞粘附、增殖和矿化基质形成。通过将miRNA介导的干细胞分化调控与CSNPs递送和仿生纤维支架结合，该策略针对再生牙髓的关键限制。总体而言，该支架是牙髓-牙本质复合体再生的有前景平台，值得进一步体内评价；后续研究应确定矿化组织的组成和组织方式、血管生成和炎症反应、支架降解及临床相关体内模型中的再生性能。
