《Nature Aging》：Deep and quantitative proteomic profiling of low-volume mouse serum in a cross-sectional analysis of aging
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评估和验证循环生物标志物对于开发小鼠生物学衰老的临床试验前指标至关重要。然而，全面的血清蛋白质组学分析受技术难题与低样本量的限制。研究人员建立了一种基于纳米颗粒（nanoparticle）的定量富集工作流程，并与数据非依赖采集质谱（data-independe
评估和验证循环生物标志物对于开发小鼠生物学衰老的临床试验前指标至关重要。然而，全面的血清蛋白质组学分析受技术难题与低样本量的限制。研究人员建立了一种基于纳米颗粒（nanoparticle）的定量富集工作流程，并与数据非依赖采集质谱（data-independent acquisition mass spectrometry, DIA-MS）联用，用于低体积小鼠血清的深度蛋白质组学分析。该方法将蛋白质组覆盖度提高了3–6倍，且中位变异系数（coefficient of variation, CV）<10%。在30只年龄分别为12、24和30个月的小鼠中，研究人员从20 μl血清中鉴定出3,992个蛋白质分组（protein groups），揭示了年龄与性别特异性变化，并捕获了衰老相关循环蛋白。仅需额外1 μl血清，邻近延伸分析（proximity extension assay, PEA）即可量化43种质谱未能检出的细胞因子。与巴尔的摩老龄化纵向研究（Baltimore Longitudinal Study of Aging, BLSA）血浆蛋白质组学的比较鉴定出保守的年龄相关循环蛋白，其中数种与人类衰弱（frailty）相关，尤以COL6A3为著。这些结果建立了一种可扩展的、适用于样本量有限的小鼠衰老生物标志物研究的方法，具有对人类健康的转化意义。
循环蛋白质组已成为人类衰老研究中备受关注的生物标志物来源。血清等血液标本富含来自多种器官的蛋白质，因易于重复采集且创伤性小而具有重要的临床潜力，已有研究证实血液蛋白能够反映人体衰老过程中的生理变化。然而，跨人类整个生命周期进行纵向采样存在实际挑战，循环蛋白质组在衡量衰老和预测健康方面的潜力尚未充分实现。小鼠模型因寿命较短，成为在衰老全过程中严格探索循环蛋白质组纵向变化的理想替代模型，但小鼠衰老研究仍缺乏全面的血清生物标志物评估手段。其核心挑战在于：血液蛋白浓度动态范围超过十个数量级，低丰度蛋白往往最具生物学信息量，却难以被质谱（mass spectrometry, MS）检出；且小鼠血液样本量较人类更为有限，尤其在需纵向采样或将样本分装进行多种检测时矛盾更为突出。尽管液相色谱-质谱（liquid chromatography-mass spectrometry, LC-MS）结合先进样本制备策略与计算工具的进展大幅改善了蛋白质组的深度、灵敏度与通量，纳米粒子（nanoparticle, NP）蛋白质冠富集已成为压缩样本动态范围、提升低丰度蛋白检测的有前景策略。但MS在检测细胞因子等"炎症性衰老"（inflammaging）关键因子方面仍力有不逮，因其内源性浓度低、分泌短暂、半衰期短且所能产生的独特可离子化胰蛋白酶肽有限。为弥补这一不足，亲和基方法如邻近延伸分析（proximity extension assay, PEA）可提供多重化循环细胞因子定量的互补方案。
为验证NP基LC-MS工作流在低体积小鼠血清深度蛋白质组学中的可行性、定量准确性与生物学敏感性，研究人员利用纵向衰老小鼠研究（Study of Longitudinal Aging in Mice, SLAM）队列的横断面子集展开研究，不同小鼠分别于12个月（年轻）、24个月（老年）和30个月（高龄）采样，意在评估深度定量血清蛋白质组学能否在适用于纵向研究的样本受限情境下实现。研究人员以人-牛血浆定比混合物基准测试NP基MS的定量性能，优化NP组分间的蛋白质水平定量策略，并将非靶向LC-MS与靶向48重PEA细胞因子面板整合，仅需少量额外血清。随后，该组合工作流被用于鉴定小鼠血清中年龄与性别相关的蛋白质组学变化，并通过与BLSA人类血浆蛋白质组数据的比较评估转化相关性。研究证实，NP基DIA-MS与低体积PEA检测相结合，可在每只小鼠仅20 μl血清的严格体积限制下实现深度定量蛋白质组学分析，为样本量有限的小鼠衰老生物标志物发现建立了可扩展的方法学框架。
研究人员的关键技术方法包括：自动化纳米粒子蛋白质冠富集系统（Seer Proteograph）联合纳升级液相色谱-串联质谱（nano LC-MS/MS），采用数据非依赖采集（data-independent acquisition, DIA）模式，原始数据以DIA-NN算法在库自由模式下搜索分析；蛋白质定量层面比较了MaxRep与MaxLFQ两种肽段-蛋白质整合策略；细胞因子检测采用Olink Target 48 Mouse Cytokine panel，基于邻近延伸分析（proximity extension assay, PEA）技术；生物信息学分析基于RStudio完成统计建模、相关分析与基因集富集分析。样本来源方面，小鼠血清取自SLAM队列的C57BL/6J小鼠横断面子集（每组10只，50%雌性），人类血浆蛋白质组学数据则来自BLSA队列经SOMAscan 7K检测的1,275名参与者。
**NP耦合血清蛋白质组学工作流程的定性与定量评估**
可行性研究显示，NP处理较未富集的原位酶解将蛋白质鉴定深度提高2–4倍。人-牛血浆定比基准实验（5%至100%牛血浆五个比例）表明，测定肽段比例与预期比例高度吻合，中位5%和100%样本肽段比值落在预期比值的0.01范围内，证实NP处理可准确保留原始样本的相对丰度关系。在衰老相关性评估中，未处理血清仅鉴定出45个SenSig（小鼠体内衰老特征）蛋白，而NP处理样本及跨衰老研究样本分别鉴定到136个和209个，且检出Igfbp2/3/4/5、Timp2/3、Thbs1、Mmp2/8等多种经典衰老相关分泌表型蛋白（senescence-associated secretory proteins, SASPs）。
**NP耦合MS在低体积小鼠血清衰老研究中的评估与优化**
在30只C57BL/6J小鼠中，每只20 μl血清累计检测28,976条独特肽段；NP2与NP5贡献最大肽段集（24,457与22,592条），各NP间肽段表达呈中至高度相关（如NP1与NP3的rho=0.83，NP2与NP5的rho=0.88）。技术重复中NP2精度最高，中位肽段水平CV仅9%，逾半数肽段CV<10%。蛋白质定量方面，两种方法均累计量化3,992个蛋白质分组（平均每个样本2,235个），MaxRep与MaxLFQ显著相关（相关系数0.77，P<0.00001），MaxRep中位蛋白水平CV为0.0567、略优于MaxLFQ的0.0613，故被用于主要分析。
**常被MS遗漏的细胞因子鉴定**
典型炎症因子如白细胞介素-6（interleukin-6, IL-6）仍未被MS检出。借助48重Olink PEA面板，仅1 μl额外血清即量化出43种炎症细胞因子，与MS仅有4种蛋白重叠，体现两法强互补性；IL-16在两种方法间定量显著相关（P=0.0085，相关系数0.7455），验证MS定量的可靠性。线性建模显示10种细胞因子随年龄线性增加，IL-21与C-C基序趋化因子配体22（CCL22）随年龄下降，CCL12变化最显著。
**血清蛋白质组的年龄相关变化**
蛋白质水平主成分分析（principal component analysis, PCA）显示样本按性别聚类、按年龄适度聚类。线性建模（蛋白~年龄+性别，错误发现率（false discovery rate, FDR）≤0.05）鉴定出73个年龄相关蛋白（54个增加、19个减少），最强正向变化包括TXNDC5、MYL3、ARPC5、LGMN与LMAN1。基因集富集分析显示12至24月龄间糖酵解与免疫相关通路富集，24至30月龄间代谢过程富集，提示老年与高龄阶段存在阶段特异性变化。
**循环蛋白与年龄变化相关的性别二态性**
Pearson线性建模（蛋白~性别+年龄）鉴定出20种雄性升高蛋白与61种雌性升高蛋白（NP-MS）；PEA细胞因子中仅IL-7在雌性更高。过表达分析显示雄性升高蛋白富集于质膜，雌性升高蛋白富集于肽酶活性等功能，凸显循环蛋白质组的性别二态性。
**与比较衰老人类血浆蛋白质组的比较**
在1,742个共同定量蛋白中，18个蛋白（占小鼠年龄相关蛋白50%）在小鼠与BLSA人类队列中均与年龄显著正相关，涉及内质网、细胞外基质与溶酶体等细胞组分。与44组分衰弱指数（frailty index）的关联分析发现，COL6A3、LBP、PIGR、IGFBP1和HPX与人类衰弱显著相关，其中COL6A3（collagen type VI alpha 3 chain）为关联最强蛋白（校正P值5.069×10
-16），并经英国生物样本库（UK Biobank）数据独立验证，将保守的循环蛋白组衰老特征与人类功能健康下降相关联。
讨论部分指出，目前缺乏能在小鼠低血液样本量下全面检测蛋白质的工具，NP基MS工作流通过压缩动态范围化解了这一难题；人-牛血浆混合基准实验表明基质成分未明显干扰蛋白质冠组成与相对定量。该工作从20 μl血清中较标准未富集工作流提升约6倍的蛋白鉴定深度，检测逾200个SenSig蛋白及CXCL12、IL-16等低丰度炎症蛋白；MS对IL-6等经典细胞因子的遗漏则凸显PEA整合的必要性。性别二态性分析显示，除2种蛋白外，所有与既往研究重叠的性别相关蛋白均呈相同方向性，印证了工作流程的准确与稳健。转化层面上，约半数小鼠年龄相关蛋白在人类中保守并与衰弱相关，支持小鼠血清蛋白质组学的转化价值。局限性在于队列规模较小（n=30）且为横断面设计，无法推断个体内衰老轨迹与因果效应，需后续SLAM更大样本量与真正纵向采样加以验证。
研究结论为：NP基DIA-MS与低体积PEA细胞因子检测相结合，可实现低体积小鼠血清的深度定量蛋白质组学分析，与纵向小鼠研究兼容。NP基MS显著提高蛋白质组覆盖度，PEA则对MS遗漏的炎症因子提供关键灵敏度；两法重叠有限，凸显其协同提升循环蛋白质组分析深度的价值。该工作流程捕获了生物学有意义的年龄、性别和阶段特异性变化，并揭示了与人类衰弱相关的保守特征，为样本受限的小鼠研究中的纵向与机制性衰老研究及生物标志物发现奠定了稳健的方法学框架。
