CAR19治疗后克隆性造血扩增与骨髓炎症驱动持续性血细胞减少、免疫重建受损及治疗相关髓系肿瘤

《Nature Genetics》：Clonal hematopoiesis and cytopenias following CAR19 therapy

　　

靶向CD¹⁹的嵌合抗原受体T细胞疗法（CAR¹⁹）较以自体造血细胞移植（autoHCT）为意向的免疫化疗可改善复发/难治性大B细胞淋巴瘤患者的生存。然而，其主要毒性包括持续性血细胞减少、感染和继发性血液系统恶性肿瘤。为探究这些并发症，研究人员纳入接受CAR¹⁹治疗的淋巴瘤患者，并将临床结局与倾向性匹配的autoHCT治疗对照进行比较。接受CAR¹⁹治疗的患者表现出免疫重建受损和感染增加。骨髓分析显示，CAR¹⁹后持续性血细胞减少与意义未明的克隆性血细胞减少（clonal cytopenias of undetermined significance）及干扰素介导的炎症相关。克隆性造血（CH）在CAR¹⁹输注后常发生扩增，并与免疫重建受损和治疗相关髓系恶性肿瘤（tMN）相关。CAR¹⁹后tMN在分子和临床上与autoHCT后tMN相当。单细胞DNA分析显示，CH克隆大多相互独立，而CAR整合进入CH突变T细胞频繁发生，并可能驱动其扩增和持续存在。综上，这些发现提示CH扩增和骨髓炎症与CAR¹⁹相关关键毒性有关。

研究背景方面，靶向CD¹⁹的嵌合抗原受体T细胞疗法（CAR¹⁹）已改变B细胞恶性肿瘤治疗格局，并在复发/难治性大B细胞淋巴瘤（LBCL）中较以autoHCT为意向的免疫化疗改善生存。但CAR¹⁹相关毒性仍是重要问题，包括细胞因子释放综合征（CRS）、免疫效应细胞相关神经毒性综合征（ICANS）、感染、持续性血细胞减少、第二原发恶性肿瘤及治疗相关髓系肿瘤（tMN）；非复发死亡（NRM）可达较高水平，感染是主要NRM原因，tMN风险随时间增加。既往化疗可导致克隆性造血（CH），尤其DNA损伤反应（DDR）基因TP53、PPM1D等突变克隆在选择性压力下扩增；CAR¹⁹患者预输注CH发生率较高，且可输注后扩增，与第二原发肿瘤及罕见CAR⁺ T细胞淋巴瘤相关。因此，研究人员需要系统解析CAR¹⁹后血细胞减少、感染和继发髓系肿瘤的分子机制。该研究发表于《Nature Genetics》。

关键技术方法方面（不超过250字）：研究基于Stanford等机构CAR¹⁹治疗LBCL及autoHCT对照队列，进行倾向性匹配临床结局分析（CAR组69例对autoHCT组69例）；对31例CAR¹⁹后血细胞减少患者行骨髓（BM）活检、流式细胞术和骨髓血浆蛋白检测；筛查533例CAR¹⁹队列tMN并与29例autoHCT后tMN比较；采用CAPP-seq分析124例化疗前与101例化疗后外周血白细胞（PBL）及169例患者1,123份纵向肿瘤、PBL和游离DNA（cfDNA）样本；行单细胞RNA测序（scRNA-seq）和单细胞DNA/抗体测序（scDNA-seq），并用扩增子检测CAR载体整合。样本来源于CAR¹⁹和autoHCT治疗LBCL患者队列及未治疗对照。

研究结果如下。**CAR¹⁹后免疫重建更慢且感染更多**：倾向匹配队列显示，CAR¹⁹组≥3级感染累积发生率显著高于autoHCT组，30天后NRM增加且主要归因于感染，白细胞、中性粒细胞和淋巴细胞恢复显著延迟。**CAR后骨髓中CAR T细胞富集与持续性CD¹⁹**：CAR¹⁹后血细胞减少患者骨髓中CD¹⁹和CAR¹⁹⁺细胞较配对PBL显著富集，未治疗对照无此现象；骨髓存在CD¹⁹⁺CD10⁺ B细胞祖细胞，提示B细胞在骨髓持续产生但外排受损。**CAR后血细胞减少骨髓的单细胞分析**：scRNA-seq显示CAR后骨髓呈T细胞和髓系偏斜、B细胞减少，非CAR T细胞呈克隆性并富集干扰素信号，CAR mRNA可持续至输注后4年以上；骨髓检测到生产性免疫球蛋白（Ig）链而配对PBL未检测到，残余B细胞以未成熟B细胞为主。**CAR后血细胞减少骨髓中CH的检测**：31例临床测序中90.3%检出突变，41.9%诊断为骨髓增生异常综合征（MDS）或急性髓系白血病（AML）；非MDS/AML者多数符合意义未明的克隆性血细胞减少，DNMT3A和TP53最常见，TP53突变与tMN发生相关而DNMT3A突变呈保护性。**CAR后tMN与autoHCT后tMN相似且来源于CH**：533例CAR¹⁹队列3年tMN累积发生率4.2%，中位发生741天；与autoHCT后tMN相比，年龄、性别、细胞遗传学风险及无进展生存无显著差异；19个tMN相关突变中15个在围输注期可检出，随后变异等位基因频率（VAF）明显上升，TP53为主导。**化疗驱动CH**：比较124例化疗前与101例化疗后PBL，化疗后CH负担显著增加，DDR相关CH最明显，且每例患者CH突变数增加。**CH与免疫恢复延迟相关**：62例未复发患者中，预输注CH与中性粒细胞和血小板恢复降低相关，调整年龄、性别和CAR-HEMATOTOX评分后仍存在；当前样本量下CH未预测tMN、ICANS或CRS。**CAR¹⁹治疗后CH扩增**：169例患者1,123份样本的CAPP-seq分析显示cfDNA与骨髓、PBL中CH负荷相关；65例配对cfDNA显示DNMT3A、TP53和PPM1D存在输注后基因选择，71%的TP53、56.8%的PPM1D和67.3%的DNMT3A突变VAF升高。**骨髓中CH基因突变的单细胞DNA分析**：scDNA-seq识别29个克隆，75.9%的CH克隆仅含单突变，多突变克隆常呈年龄相关CH后DDR突变的序列；DDR突变在髓系富集，DNMT3A和TET2在淋巴与髓系分布较均等。**CAR¹⁹以CD4⁺ T细胞群体持续存在**：75%的远隔骨髓低水平检出CAR¹⁹，CAR⁺细胞中94.8%为T细胞，79.8%为CD4⁺ T细胞，显著高于CD8⁺，与早期扩增以CD8⁺为主相反；CAR未见于tMN细胞。**CH扩增发生在髓系 compartment**：16例患者22份PBL scDNA-seq显示CH扩增主要见于髓系而非淋巴系；CAR⁺CH突变细胞常见，DNMT3A富集而TP53、PPM1D几近排除。**CAR载体频繁整合入既存CH**：13例已知CH患者峰值扩增PBL中8例检出CAR⁺CH突变细胞，DNMT3A最常见、TET2次之，TP53和PPM1D几乎完全排除；CH突变细胞占CAR⁺群体0–61.5%，多例超过20%，并有扩增期选择和后续持续证据。

讨论部分总结指出，CAR¹⁹后感染和tMN是NRM常见原因；血细胞减少机制是多因素的，涉及预存DNA损伤、持续性B细胞缺失与骨髓B细胞产生后被残余CAR T细胞破坏、持续存在且骨髓富集的CD4⁺ CAR T细胞、克隆性非CAR T细胞的干扰素程序、髓系CH扩增及罕见tMN转化。持续炎症可驱动CH扩增并偶致tMN；post-CAR tMN主要源于TP53突变克隆，常呈多打击，与autoHCT后tMN在分子风险和临床结局上相似，不支持其为独特实体，多次细胞治疗与tMN发生相关。DNMT3A/TET2在淋巴系的分布可解释DNMT3A相关tMN保护现象及TET2相关CAR⁺ T细胞淋巴瘤。CAR载体整合入既存CH较常见，尤其DNMT3A，可能促进CAR扩增和持续，但单独不足以驱动T细胞淋巴瘤。研究结论部分翻译为：综上，这些发现提示CH扩增和骨髓炎症参与CAR¹⁹相关关键毒性；CAR后CH克隆在炎症骨髓环境中扩增，损害造血并偶尔进展为恶性肿瘤。