反离子6-三氟甲基尿嘧啶与Cl?对双-(1,10-菲咯啉)氯化铜(II)骨架光谱及体外抗肿瘤/抗菌活性的调控

《European Journal of Inorganic Chemistry》：Influence of 6-Trifluoromethyluracil Versus Chloride Counterions in the Properties of Bis-(1,10-Phenanthroline)chloridecopper(II) Motif: Spectroscopic and In Vitro Biological Activity Assays

　　

铜(II)金属核酸酶（copper(II) metallonucleases）已成为有希望替代铂类药物的化合物类别。研究人员评估了不同反离子，即6-三氟甲基尿嘧啶（6-trifluoromethyluracil, 6tfmu）与氯离子（Cl^?），对含双-(1,10-菲咯啉)氯化铜(II)（bis-(1,10-phenanthroline)chloridecopper(II)）基序的铜(II)配合物生物活性的影响。化合物通过化学与光谱测量进行表征。对[Cu(phen)₂Cl]6tfmu (1)开展了晶体学研究，而配合物[Cu(phen)₂Cl]Cl (2)的数据此前已有描述。体外抗增殖实验表明，两种配合物的IC₅₀值均低于顺铂（cisplatin），其中黑色素瘤A375细胞最敏感，配合物1和2分别为1.3和0.9 μM。两种化合物以不可区分程度结合DNA，其方式为小沟识别与单个菲咯啉（phenanthroline）配体部分插入相结合的杂合模式。对共同[Cu(phen)₂Cl]⁺阳离子开展的分子动力学（molecular dynamics, MD）与微孔板荧光团实验均支持该模式。配合物1和2产生的主要活性氧（reactive oxygen species, ROS）分别为·OH和H₂O₂。在人拓扑异构酶I（human Topoisomerase-I）介导的DNA松弛实验中的底物耗竭实验表明，[Cu(phen)₂]²⁺基序更倾向于降解DNA底物，而非直接抑制酶本身。反离子调节抗菌效力及主要反应性物种的身份，而共同阳离子对DNA的识别基本不变。

研究背景方面，癌症是可在几乎任何器官或组织发生的疾病群，以异常细胞失控增殖为特征，是全球第二大致死原因；2022年约有2000万新发病例和970万死亡，接近每六例死亡中有一例。皮肤癌占全球最常诊断癌症的三分之一，其中非黑色素瘤皮肤癌以鳞状细胞癌（squamous cell carcinoma, SCC）和基底细胞癌（basal cell carcinoma, BCC）最常见。传统放疗和化疗存在局限，铂类药物虽抗肿瘤有效，但可造成肾脏和神经系统毒性，因此研究人员关注过渡金属化疗剂。铜(II)金属核酸酶可通过直接DNA损伤以及经氧化还原反应产生ROS引发氧化应激，Casiopeinas等铜(II)配合物已进入抗肿瘤临床研究。人工金属核酸酶（artificial metallonucleases, AMN）可模拟核酸酶切割核酸并诱导凋亡，[Cu(phen)₂]²⁺是经典AMN基序。1,10-菲咯啉框架本身也是抗菌药效团，其铜(II)配合物可结合膜扰动和胞内氧化还原循环产生ROS；[Cu(phen)₂Cl]⁺平台因此可用同一结构变量测试抗肿瘤和抗菌两类生物读出。选择6tfmu作为反离子具有依据：去质子化尿嘧啶衍生物生物相容、弱碱性、生理pH易得；5-氟尿嘧啶铜配合物已显示金属中心与抗代谢核碱基反应性可结合。将氟取代从C5移至C6并以三氟甲基替代氟，保留核碱基骨架，同时增加脂溶性和N─H酸性，改变离子配对与水溶性；晶体学确认6tfmu在实验条件下氧化惰性，不与菲咯啉或氯离子竞争金属，因此它提供最小且化学保守的扰动，使阳离子、电荷和供体组保持不变。比较[Cu(phen)₂Cl]6tfmu与[Cu(phen)₂Cl]Cl可区分反离子贡献与金属配合物贡献。研究目的即评估6tfmu和氯离子作为反离子如何调节双-(1,10-菲咯啉)氯化铜(II)配合物的化学和生物学性质，并研究DNA结合、切割及hTopoI相关作用。

关键技术方法方面，研究人员采用单晶X射线衍射（single-crystal X-ray diffraction, SCXRD）解析配合物1，配合物2采用Onawumi et al.已发表数据；用红外光谱（infrared spectroscopy, IR）、电子顺磁共振（electron paramagnetic resonance, EPR）和UV–vis进行表征及24 h溶液稳定性研究；用圆盘扩散法测试S. aureus ATCC 25923、E. faecalis ATCC 29212、E. coli ATCC 25922、P. aeruginosa PAO1和S. enterica ATCC 14028；用MTT法测试FaDu、A375、SK-MEL-28及非肿瘤HaCaT细胞，细胞系来源于Rio de Janeiro cell bank（BCRJ, Brazil）；用噻唑橙（thiazole orange, TO）置换及TO与Hoechst 33258猝灭实验评估DNA结合；用琼脂糖凝胶电泳评估自激活切割、抗坏血酸存在下切割及ROS清除剂实验；用人拓扑异构酶I（human Topoisomerase I, hTopoI）介导的φX174 RF DNA松弛实验评估底物耗竭；用Amber22、MetalDock和MM-GBSA对[Cu(phen)₂Cl]⁺与DNA十聚体进行MD模拟。

研究结果如下。4.1 SCXRD：SCXRD显示配合物1和2均为单体结构；1属三斜空间群P-1，含一个[Cu(phen)₂Cl]⁺、单去质子化6tfmu反离子和两个结晶水；2属单斜空间群C2/c，含相同[Cu(phen)₂Cl]⁺但以氯离子为反离子。两者铜离子均为五配位，菲咯啉以双齿方式配位；τ值1为0.432、2为0.882，说明1为高度扭曲的四方锥，2更接近三角双锥。配合物1中Cu1–N4键长2.219 ?，长于其他Cu─N键（2.001–2.043 ?），归因于Jahn–Teller效应导致轴向键拉长。4.2 IR：6tfmu中N─H、C═O和CF₃特征振动在配合物1中发生位移，且一个N─H伸缩带消失，支持一个氮去质子化形成带负电反离子；菲咯啉的C═N、C═C和C─H振动在1和2中均位移，支持[Cu(phen)₂]²⁺基序形成；两配合物中O─H伸缩带表明含水。4.3 EPR：配合物2的g_⊥ > g_// ≈ g_e，提示d_z²基态和三角双锥五配位；配合物1显示三个分辨峰，呈菱形配位环境，R = (g₂?g₃)/(g₁?g₂)小于1，d_x²?y²贡献较大，但基态混合，支持扭曲四方锥，与XRD一致。4.4 UV–vis稳定性与形态分布：在0.5% DMSO中24 h内，1的231/270 nm和2的232/271 nm吸收带轮廓无显著变化，表明[Cu(phen)₂]²⁺基序保持，未发生明显水解或配体交换。4.5 体外抗菌活性：圆盘扩散法中，6tfmu和CuCl₂均无抗菌活性；配合物1对S. aureus和E. coli有活性，抑菌圈21.6和22.3 mm，但总体低于菲咯啉；配合物2对所有测试菌株均有显著活性，对E. faecalis抑菌圈达40 mm，对S. aureus和E. coli活性约为1的1.6倍；2更高的水溶性可能改善琼脂扩散，6tfmu作为反离子降低甚至阻碍[Cu(phen)₂Cl]⁺基序的抗菌活性。4.6 体外抗增殖活性：MTT实验显示两配合物对全部肿瘤细胞系均有强活性，A375最敏感，IC₅₀分别为1.35和0.93 μM；FaDu为1.79和1.61 μM；SK-MEL-28为7.30和4.14 μM；对A375的效力约为SK-MEL-28的5.4和4.5倍。与菲咯啉和CuCl₂相比，配合显著增强活性；在FaDu中，1和2相对菲咯啉约提高20和22倍，相对CuCl₂提高94和104倍。与顺铂相比，1和2在FaDu中约强5.5和6倍，在A375中约强3.8和5.6倍，在SK-MEL-28中约强1.6和2.9倍。两配合物抗增殖活性相当，处于同一数量级和MTT实验不确定度内，因此未解释为反离子效应；同时化合物对肿瘤细胞与HaCaT非肿瘤细胞缺乏选择性。4.7 DNA结合评估：4.7.1 微孔板荧光团实验显示，TO置换实验中1的C₅₀为146.4 μM、K_app为8.61×10⁴ M bp^?1，2的C₅₀为163.0 μM、K_app为7.73×10⁴ M bp^?1，提示DNA可能是两者靶点；TO和Hoechst 33258猝灭实验中两者均可诱导50%荧光下降，Hoechst实验Q值更低，表明兼具部分插入和小沟结合，并略偏好小沟。4.7.2 琼脂糖凝胶电泳中，无还原剂时5 μM起可见pUC19超螺旋（supercoiled, SC）向开环（open circular, OC）转化，7.5 μM增强，高浓度出现线性（linear, L）形式，说明两者具自激活金属核酸酶活性；加入抗坏血酸后切割在0.001–3.0 μM范围发生，2.0 μM时DNA条带完全消失，说明氧化性切割。ROS清除剂实验表明，配合物1主要涉及·OH，并有部分¹O₂，L-甲硫氨酸有效提示H₂O₂和HOCl可能参与；配合物2以H₂O₂为主，¹O₂次要。讨论指出两化合物共用氧化还原活性阳离子，但溶解性和向DNA表面的分配不同，导致观察到的切割主导物种不同，而非根本机制不同。4.8 MD：MD模拟研究[Cu(phen)₂Cl]⁺与DNA十聚体，采用预嵌入模型和规范B-DNA模型；对接后200 ns MD显示预嵌入模型中一个菲咯啉配体部分插入碱基对，另一部分朝向小沟，规范B-DNA中则偏好小沟定位；两种结合模式在模拟中保持稳定。SASA在部分嵌入模式较低，NCI分析显示插入配体与碱基形成π–π堆积，另一配体与小沟发生非共价相互作用；部分插入使DNA长度增加约3–4 ?；MM/GBSA结合自由能为小沟结合?12.9 kcal mol^?1、部分嵌入?20.6 kcal mol^?1，后者主要由更有利的范德华相互作用驱动，支持部分嵌入与小沟识别的杂合模式。4.9 氧化还原激活的核酸酶活性及拓扑异构酶I介导DNA松弛实验中的底物耗竭：无酶时，配合物在30 min内使φX174 RF超螺旋DNA浓度依赖性转为OC，10 μM时SC几乎完全转为OC；与含DTT缓冲液预孵育24 h导致质粒广泛降解，支持DTT也促进涉及Cu(II)的Fenton型机制和ROS持续产生。hTopoI实验中，1.0–5.0 μM时仍见类似对照的拓扑异构体分布；10 μM时松弛拓扑异构体梯消失，出现OC和L而非SC积累，说明表观hTopoI活性丧失源于化学切割耗竭超螺旋底物，而非直接抑制酶。两配合物可描述为通过双重模式作用的“人工核酸酶”：部分插入使铜中心靠近DNA螺旋，氧化还原活性金属中心利用还原环境产生ROS并导致链切割；该行为类似博来霉素（bleomycin）的“自杀”核酸酶机制，并在质粒松弛实验中通过消耗hTopoI所需底物模拟酶抑制。

讨论与结论部分强调，应清楚区分阳离子依赖效应与反离子依赖效应：DNA识别属于前者，两化合物结合常数不可区分且结合模式相同；反离子改变抗菌效力和质粒切割中占主导的反应性物种，这些效应最易从溶解度、递送及阳离子局部环境理解。配合物2对所有测试菌株的抗菌活性较1提高近两倍；配合物1在清除剂实验中显示参与质粒DNA切割的ROS种类更丰富。总体而言，该工作突出[Cu(phen)₂Cl]⁺基序配合物作为化学核酸酶值得进一步开发，但在所测细胞组中未区分肿瘤与非肿瘤细胞；同时提示反离子常被视为惰性记录细节，却是值得有意识选择和报告的变量。研究结论（译文）：本研究旨在拓展铜(II)金属核酸酶的化学，重点评估反离子对[Cu(phen)₂Cl]⁺基序化学和生物活性的作用。化合物通过IR、EPR、XRD和一系列生物物理实验评价，并辅以MD计算。两种配合物表现出相当的体外抗增殖效力，在所有研究的肿瘤细胞系中超过其前体甚至顺铂。其产生ROS并通过部分插入和小沟结合与DNA相互作用，且偏好小沟识别和相互作用，提示多条生物分子途径可能参与其细胞毒机制。有必要清楚区分依赖阳离子与依赖反离子的效应：DNA识别属于前者，两种化合物给出不可区分的结合常数和相同杂合结合模式；反离子改变的是抗菌效力和质粒切割中占主导的反应性物种，这些效应最易从溶解度、递送和阳离子局部环境理解。与配合物1相比，配合物2对所有测试菌株的抗菌活性提高近两倍，而前者在琼脂糖凝胶电泳清除剂实验中显示参与质粒DNA切割机制的ROS种类更丰富。总体而言，该工作突出[Cu(phen)₂Cl]⁺基序配合物作为值得进一步开发的化学核酸酶的潜力，同时在本研究所用细胞组中这些化合物均未区分肿瘤与非肿瘤细胞；还表明反离子常被视为惰性记录细节，但值得有意识地选择和报告。