《Nature Methods》：Selective profiling of translationally active tRNAs and their dynamics under stress
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在翻译（translation）过程中，转运RNA（transfer RNA，tRNA）以与信使RNA（messenger RNA，mRNA）编码序列相协调的方式，将特定氨基酸递送至核糖体（ribosome）。尽管tRNA在蛋白质合成中发挥核心作用，但由于缺乏
在翻译（translation）过程中，转运RNA（transfer RNA，tRNA）以与信使RNA（messenger RNA，mRNA）编码序列相协调的方式，将特定氨基酸递送至核糖体（ribosome）。尽管tRNA在蛋白质合成中发挥核心作用，但由于缺乏能够表征来自活跃翻译核糖体的tRNA丰度及其修饰（modification）的方法，tRNA对翻译调控的精确贡献仍知之甚少。研究人员开发了tRIBO-seq，一种基于纳米孔（nanopore）测序的简便且稳健的方法，可从活跃翻译的核糖体中选择性捕获核糖体相关天然tRNA群体（ribo-tRNAs，核糖体相关tRNA），并在单次实验中同时提供tRNA丰度（tRNA abundance）、修饰及片段化（fragmentation）信息。利用tRIBO-seq，研究人员发现胁迫条件下ribo-tRNAs发生显著改变，而总tRNA（total tRNAs）往往未发生显著变化。值得注意的是，tRNA组（tRNAome）的改变因胁迫类型不同而存在显著差异：病毒（virus）感染与亮氨酸（leucine）剥夺导致ribo-tRNA丰度改变，而甲硫氨酸（methionine）饥饿则引起tRNA甲基化修饰（methyl-based modification）的显著丢失。相比之下，亚砷酸盐（arsenite）暴露不改变tRNA丰度与修饰模式，而是引起特定ribo-tRNA亚群中的主要片段化事件。综上所述，tRIBO-seq提供了一种稳健且可重复的方法，可在单次实验中绘制完整tRNA图谱（tRNA landscape），同步捕获总tRNA与活跃翻译tRNA群体的丰度、修饰及片段化模式，以前所未有的分辨率揭示tRNA组的动态变化。
研究背景：中心法则描述了遗传信息从DNA经信使RNA（messenger RNA，mRNA）流向蛋白质的过程，但真核生物中mRNA丰度与蛋白质水平的相关性常较低，凸显了mRNA之外后转录调控机制的重要性。转运RNA（transfer RNA，tRNA）作为分子适配器，通过反密码子（anticodon）与mRNA密码子配对，将正确的氨基酸递送至核糖体（ribosome）以掺入新生多肽链。tRNA携带丰富的RNA修饰（真核生物中每个tRNA平均约13个修饰），对稳定tRNA结构、维持密码子–反密码子相互作用及防止移码突变至关重要；既往研究显示特定修饰可在胁迫暴露下改变，使tRNA被视为蛋白质合成的调节因子。然而，鉴定动态修饰的方法存在局限：液相色谱–质谱（liquid chromatography–mass spectrometry，LC–MS）可定量修饰变化却无法定位至具体tRNA及位点；修饰特异性测序技术仅能检测少数改变沃森–克里克配对区的修饰；纳米孔tRNA测序（Nano-tRNAseq）虽可同步评估丰度与修饰，但以往研究多聚焦总tRNA（total tRNA），而胁迫条件下总tRNA群体并不能反映细胞的真实翻译状态——核糖体相关tRNA（ribo-tRNAs）被认为更能代表翻译状态，但其分离依赖繁琐耗时的蔗糖密度梯度离心（polysome profiling），且需大量起始材料，高效简便的捕获方法长期缺失。
研究人员开展的研究：研究人员开发了基于纳米孔的高通量方法tRIBO-seq，利用RiboLace smart probe进行无标签、无抗体的核糖体pull-down，从经放线菌酮（cycloheximide，CHX）预处理、核酸酶消化的细胞裂解液中一步分离核糖体结合组分，结合小RNA分离与splint adaptor连接、纳米孔直接RNA测序，可在单次实验、单一测序平台上同步定量总tRNA与ribo-tRNAs的丰度、修饰及片段化信息。研究得出核心结论：稳态营养条件下ribo-tRNAs与总tRNA高度一致，而不同胁迫以刺激特异性方式重塑tRNA组（tRNAome），即病毒感染的密码子需求、氨基酸剥夺的tRNA丰度变化、甲硫氨酸饥饿的广泛低甲基化（hypomethylation）及亚砷酸盐（arsenite）诱导的核糖体相关tRNA片段化，且ribo-tRNAs较总tRNA对胁迫更敏感。该工作发表于《Nature Methods》，为解析tRNA组动态提供了稳健、快速、低投入的研究工具，揭示tRNA是翻译调控的重要参与者。
关键技术方法：CHX预处理稳定核糖体–mRNA–tRNA复合物；核酸酶消化后以RiboLace smart probe进行无标签pull-down分离核糖体并洗脱RNA；小RNA组分经splint adaptor连接后采用牛津纳米孔直接RNA测序（总tRNA经Nano-tRNAseq建库）。配套技术包括：蔗糖梯度离心多聚体分析（poly-seq）正交验证、核糖体印记（Ribo-seq）、基于碱基识别错误的差异修饰分析（DESeq2）、LC–串联质谱（LC–MS/MS）核苷定量；分析含Guppy碱基识别、minimap2比对、P位（P-site）密码子使用度分析（Percudani规则）。样本队列来源于HEK293T、MCF-7、A549细胞系及水泡性口炎病毒（VSV）感染A549细胞模型。
研究结果：
测序翻译活跃的tRNA：对标准培养HEK293T细胞的分析显示，ribo-tRNAs与总tRNA总体高度一致，但起始甲硫氨酸tRNA（iMet-CAT）在ribo-tRNAs中显著富集，与其在翻译起始中的必需作用相符；色氨酸tRNA（Trp-CCA）与硒代半胱氨酸tRNA（SeC-TCA）显著减少，与其在蛋白质组中的稀缺性一致；两类群体的修饰模式仅存微小差异，且ribo-tRNAs的CCA尾更完整。与poly-seq结果强相关（Pearson’s r=0.89，P<0.001），RNA回收效率约高18倍（37%对2%）。
tRIBO-seq捕获翻译起始动态：哈林顿碱（harringtonine，HAR）处理使核糖体停滞于起始密码子，ribo-tRNAs中iMet-CAT显著富集而总tRNA无变化；ribo-tRNAs与核糖体P位密码子使用度的相关性显著强于总tRNA（氨基酸水平rho=0.76对0.57），验证其对功能活跃tRNA的特异性捕获。
病毒驱动的密码子需求反映在ribo-tRNAs中：VSV感染6小时后，ribo-tRNAs按感染状态沿第一主成分（PC1）清晰分离而总tRNA基本不变；差异ribo-tRNA丰度与病毒–人类密码子使用差异显著正相关（r=0.64，P=3.8×10
?5），总tRNA无相关性，表明病毒重塑的密码子需求选择性重塑ribo-tRNA组成。
ribo-tRNAs对多种氨基酸剥夺敏感：精氨酸（Arg）或亮氨酸（Leu）剥夺3小时后，ribo-tRNAs沿PC1显著分离而总tRNA聚类较弱，两类饥饿均使iMet-CAT富集；多种Leu tRNA同功受体（isoacceptors）在Leu饥饿的ribo-tRNAs中显著富集，Arg饥饿时Arg-tRNA呈渐进性增加（延长至6及16小时）。
甲硫氨酸饥饿改变tRNA修饰模式：MTAP缺陷的MCF-7细胞经6及16小时甲硫氨酸（Met）剥夺后，tRNA丰度基本稳定，但16小时剥夺引起总tRNA广泛低甲基化，ribo-tRNA低甲基化较温和且重叠于已知甲基化位点；甲硫氨酸饥饿显著上调甲硫氨酸腺苷转移酶2A（MAT2A）；LC–MS/MS证实多数甲基化核苷呈降低趋势，m1A在16小时显著降低（P≤0.05）。
氧化应激触发ribo-tRNAs中的tRF形成：1 mM亚砷酸盐处理50分钟引起翻译全局关闭及综合应激反应（HSPA、ATF3、PPP1R15A上调），ribo-tRNA丰度显著改变（14种）而总tRNA仅2种，解码半胱氨酸、谷氨酸、甘氨酸（谷胱甘肽前体）的tRNA一致减少；修饰模式无显著变化，但4种tRNA（Asp-GTC、Lys-CTT、Val-TAC、Lys-TTT）在ribo-tRNAs中显著片段化，位点解析分析显示切割集中于约49位附近（真实切割位点约34–36位，对应反密码子区域），符合血管生成素（angiogenin）在核糖体激活的报道；其他处理条件下未发现显著富集，排除建库假象。
讨论部分：研究人员指出，tRIBO-seq将样本处理至测序的流程压缩在5小时内，所需核糖体嵌入RNA仅3–5 μg（约500万细胞），远低于经典蔗糖梯度法，且可从同一核糖体样本回收mRNA进行Ribo-seq，实现密码子–反密码子互作的整合分析。研究系统揭示四种胁迫下tRNA组的特异性重编程：稳态下tRNA供给与翻译需求紧密协调；病毒、氨基酸剥夺、Met饥饿与氧化应激分别通过丰度重分配、同功受体富集、甲基化丢失与片段化等维度重塑ribo-tRNAs，而总tRNA组在各类外界刺激下总体保持稳定，凸显同时考察两类群体的必要性。局限包括：方法性能依赖细胞翻译活性；目前仅在哺乳动物细胞系验证；去酰化步骤使其无法区分氨酰化与去氨酰化tRNA；因偏好连接CC(A)结尾转录本，仅能捕获3′ tRF而不能捕获5′ tRF。
研究结论（翻译）：tRIBO-seq是一种稳健、高分辨率且易获取的方法，可在单次实验中、从单一测序平台与单一样本同步定量tRNA丰度、修饰图谱与片段化模式，涵盖总tRNA与活跃翻译tRNA群体，以前所未有的分辨率揭示胁迫条件下tRNA组的动态重编程，为解析tRNA在生理与胁迫条件下的经典与非经典功能提供了有力工具。
