连续细针穿刺RNA测序揭示三阴性乳腺癌PDX模型对化疗敏感性的早期转录与细胞因子反应差异

《Oncogene》：Early temporal transcriptional and cytokine responses distinguish chemotherapy sensitivity in patient-derived xenograft models of triple-negative breast cancer

化疗仍是三阴性乳腺癌（TNBC）新辅助治疗的支柱，且对化疗的反应与患者预后密切相关。然而，预测化疗耐药仍是主要临床挑战。为应对这一障碍，研究人员对化疗敏感或化疗耐药的TNBC患者来源异种移植（PDX）模型进行了连续细针穿刺（FNA）并结合RNA测序（RNA-seq）。研究人员发现，这两类PDX模型表现出不同的转录轨迹，且在化疗开始后一周内出现分歧，早于可测量的肿瘤体积变化。在早期时间点，化疗敏感肿瘤显示凋亡和细胞因子相关通路激活，而化疗耐药模型缺乏这些变化。值得注意的是，化疗敏感肿瘤中的细胞因子上调与化疗后七天内髓源性免疫细胞浸润至瘤床相一致，表明即使在小鼠缺乏完整免疫系统时也存在活跃的微环境重塑。对TNBC患者治疗前及首次化疗剂量后四天内采集的配对活检进行分析，揭示一致模式：化疗敏感肿瘤上调炎症通路，而化疗耐药肿瘤显示这些通路激活减弱。这些结果强调早期治疗中肿瘤采样以检测化疗耐药并指导治疗干预的潜在临床价值。

研究背景方面，三阴性乳腺癌（TNBC；缺乏雌激素受体、孕激素受体表达及HER2扩增或过表达的乳腺癌亚型）侵袭性强。由于TNBC按缺乏上述特征而非存在可操作生物标志物分类，靶向治疗应用受限，新辅助化疗（NACT；术前化疗）联合或不联合免疫治疗仍是早期患者治疗的基石。患者预后与NACT反应密切相关，治疗后残余癌症负荷（RCB）较高者复发风险显著增加、生存更差。尽管化学免疫治疗几乎是所有TNBC新辅助治疗的标准，但约40–50%患者对单纯化疗有反应，免疫治疗仅使反应率提高约15%，因此识别可能仅对化疗有反应者有助于对无免疫治疗获益者降阶治疗并减少毒性。治疗前预测NACT反应仍困难：多项回顾性研究鉴定的耐药相关基因表达特征阳性预测值过低，且不同化疗方案造成解释复杂化；TNBC PDX模型研究还发现不同化疗治疗的反应相关基因集大多不重叠，提示方案特异性变异。既往研究显示敏感和耐药肿瘤在治疗后存在基因表达和通路激活差异；研究人员所在实验室曾发现阿霉素联合环磷酰胺（AC）治疗后21天出现短暂转录状态，肿瘤转为依赖氧化磷酸化生存，提示早期转录谱可能预测治疗结局。基于此，研究人员检查一个化疗周期内未治疗肿瘤的转录变化，发现早期化疗敏感肿瘤遵循独特转录轨迹而耐药肿瘤缺乏该轨迹，敏感肿瘤在第7天炎症和凋亡通路显著上调，早于可测肿瘤体积差异，并伴有髓源性免疫细胞增多；这些结果提示化疗耐药或敏感性可在治疗第一周内检测，可能支持早期终止无效治疗并转向更有效替代方案。

关键技术方法概括（不超过250字）：研究人员建立TNBC PDX纵向FNA采样方案，在肿瘤体积100–150 mm³时随机给予单剂AC或溶媒，于第0、2、7天及后续每周采集FNA，提取RNA行bulk RNA-seq并仅分析人源转录本；采用Hallmark、MSigDB C2、ssGSEA/GSEA评估通路，免疫组化（IHC）检测裂解型caspase-3（CC3；晚期凋亡标志物）和髓过氧化物酶（MPO；髓系细胞标志物）；分析I-SPY1试验GEO GSE32603中35例（6例病理完全缓解[pCR]、29例non-pCR）T1与T2配对活检，以及多西他赛/卡铂队列T1与Cycle1 Day3配对数据，并用MCPcounter推断免疫细胞。样本来源包括MD Anderson PDX、I-SPY1及多西他赛/卡铂队列。

研究结果如下。首先，在“AC敏感和耐药TNBC PDX模型中的时间转录组动态”方面，研究人员通过纵向FNA RNA-seq比较溶媒与AC治疗PDX模型，发现PIM001-P、PIM001-M和PIM005等敏感模型肿瘤缩小并呈现7天内显著转录重塑、后向基线回归，而PIM040和PIM300等耐药模型无显著体积下降且缺乏清晰时间结构，表明敏感与耐药模型的转录轨迹在早期分歧并早于体积变化。其次，在“早期凋亡和炎症特征界定AC治疗模型化疗敏感肿瘤消退”方面，研究人员用Hallmark基因集ssGSEA发现敏感模型第7天通路激活峰，PIM005在第7–15天持续升高，耐药模型缺失；第7天炎症和凋亡通路最显著，最大消退时（约第21天）转录谱提示代谢关闭，后期细胞周期程序再激活；扩展耐药模型及C2基因集分析显示敏感模型显著改变基因和通路更多，38条上调通路中炎症相关通路富集；PIM137虽耐药但炎症通路上调，耐药模型还显示角蛋白KRT5、KRT14、KRT19、KRT81及细胞外基质重塑通路变化。第三，在“早期凋亡诱导区分TNBC PDX肿瘤化疗反应”方面，凋亡相关基因签名在第7天达峰，CC3 IHC显示敏感肿瘤第4天升高、第7天峰值、第21天下降，耐药肿瘤诱导微弱；ABC转运体ABCB1、ABCC1、ABCG2基线表达未见耐药模型升高，而抗凋亡BCL-2家族中PIM025、PIM242、PIM300的BCL2A1升高、PIM040的BCL2L2高1.3倍，提示耐药可能与抗凋亡表达相关。第四，在“TNF-α/NF-κB激活和第7天细胞因子激增区分化疗敏感与耐药TNBC PDX肿瘤”方面，研究人员分析TNF-α、NF-κB和IFN相关签名，发现敏感模型第7天显著升高而溶媒治疗无此变化；KEGG细胞因子-细胞因子受体相互作用通路中超过三分之一基因在第7天较第0天上调至少2倍，包括TNF超家族、多种白细胞介素和干扰素及趋化因子/细胞因子，表明敏感肿瘤细胞因子环境广泛重塑。第五，在“MPO⁺细胞募集至化疗敏感而非化疗耐药PDX肿瘤”方面，MPO IHC显示敏感肿瘤AC后第7天MPO⁺细胞流入，耐药模型PIM025、PIM040、PIM242、PIM300同期MPO染色极少；PIM137第0天MPO⁺细胞最多且AC后进一步增加，与转录水平细胞因子通路诱导一致，表明化疗敏感肿瘤发生髓源性免疫细胞募集而耐药肿瘤大多缺乏。第六，在“乳腺癌患者化疗耐药肿瘤中炎症信号降低”方面，研究人员分析I-SPY1配对活检，发现non-pCR肿瘤T2时同种异体移植排斥、凋亡、IL-2-STAT5、IL6-STAT3、炎症反应、IFN-α、IFN-γ及TNF-α经NF-κB信号等炎症相关通路显著下降，而pCR肿瘤倾向升高；MCPcounter显示non-pCR肿瘤T2时中性粒细胞和单核细胞谱系降低，B细胞、T细胞、内皮细胞和成纤维细胞亦降低；多西他赛/卡铂队列第3天未见显著炎症通路变化而见顶端极化相关通路变化，提示该炎症反应可能对AC治疗相对特异。

讨论部分总结：研究人员识别出区分TNBC PDX模型化疗敏感与耐药的转录轨迹，关键时间窗为AC治疗后第4–7天，早于可测肿瘤消退和残余肿瘤状态建立；敏感模型表现为凋亡增加、细胞因子谱激活和髓系细胞富集，耐药模型显著减弱。FNA可能造成组织损伤并诱导炎症基因变化，但溶媒与AC治疗比较显示化疗反应是观察到的炎症变化的主要驱动因素。耐药机制方面，耐药模型ABC家族药物外排转运体表达未较敏感模型升高，提示药物外排不太可能是主要机制；耐药模型抗凋亡BCL-2家族成员表达升高，与既往将其联系到化疗耐药的研究一致；BCL2A1和多种角蛋白上调是耐药肿瘤少数共同转录特征。凋亡受损可能减少细胞因子和趋化因子释放，从而贡献耐药肿瘤减弱的炎症反应；但耐药模型PIM137未发生AC诱导凋亡却上调炎症通路并募集MPO⁺细胞，提示AC诱导的炎症相关变化可先于凋亡，但单独不足以在所有情境诱导肿瘤细胞死亡。阿霉素和环磷酰胺均为TNF-α诱导剂，TNF-α可促进凋亡并刺激其他细胞因子/趋化因子产生，且可由癌细胞和髓系细胞诱导并进一步放大髓系募集，与敏感肿瘤TNF-α信号增加和髓系细胞扩增一致，提示存在促进有效杀伤的正反馈炎症回路。既往研究显示TNF-α和IFN可使中性粒细胞向抗肿瘤表型极化，结直肠癌中MPO⁺细胞高浸润与良好预后相关，但髓源性细胞可促瘤亦可抑瘤，仍需患者肿瘤和免疫健全模型研究化疗引发的多样反应，并评估化学免疫治疗；免疫治疗反应时间通常较长，早期细胞因子变化不太可能被免疫治疗抑制，免疫细胞作为细胞因子主要来源，额外免疫群体募集甚至可能增强细胞因子释放，未来应监测细胞因子动态及其对肿瘤免疫微环境的影响以寻找早期反应生物标志物。NACT反应仍是TNBC结局关键决定因素，免疫治疗单药疗效有限故与化疗联合提高pCR率，含蒽环类方案优于其他化学免疫联合方案，提示识别AC反应生物学机制重要；与多西他赛/卡铂治疗患者比较提示炎症签名可能对AC反应特异。ARTEMIS分析显示几乎所有pCR患者呈“免疫热”微环境但部分免疫热肿瘤仍耐药，单细胞测序识别出与免疫热微环境和总生存改善相关的干扰素反应状态，提示免疫微环境和肿瘤细胞内在特性均为化疗反应关键决定因素。PIM137虽对AC耐药却表现细胞因子通路上调和髓系细胞募集，其对应患者AC单药未消退但后续atezolizumab联合paclitaxel治疗被消除；PIM300同样来自AC不反应肿瘤但未上调细胞因子通路，患者亦未对atezolizumab反应，提示PIM137和敏感肿瘤中的细胞因子表达可能贡献更利于免疫治疗反应的微环境，未来化学免疫治疗中治疗中活检对确定免疫热微环境与肿瘤细胞内在反应性互作是否驱动治疗获益至关重要。研究结论部分翻译：总之，研究数据表明化疗敏感肿瘤在化疗治疗第一周内发生广泛转录反应，而化疗耐药肿瘤的反应相较减弱；化疗敏感肿瘤中测得的转录变化早于任何可测肿瘤体积变化，强调早期治疗中采样对及时检测反应性或耐药性的重要性；化疗敏感肿瘤的转录反应伴随肿瘤细胞死亡激增、重塑的细胞因子格局和髓源性免疫细胞数量增加；识别这一早期反应的关键细胞因子介质可能为增敏化疗耐药肿瘤提供治疗途径。