海枣（Phoenix dactylifera L.）种仁石油醚萃取物对淡色库蚊（Culex pipiens L.）的杀虫活性及其化学成分研究

《Scientific Reports》：Phoenix dactylifera L. (Arecaceae) seed as a source for insecticide candidates against the mosquito Culex pipiens L. (Diptera: Culicidae)

　　

摘要：为控制蚊虫而大量使用合成化学杀虫剂已导致蚊虫产生抗药性；因此，人们筛选环境友好的植物源杀虫剂作为化学杀虫剂的替代品。目前关于利用水果种子废弃物生产绿色生物杀虫剂的报道十分有限。因此，本研究旨在测定五种水果种子提取物对淡色库蚊（Culex pipiens）的杀虫活性。研究人员测试了杏（Prunus armeniaca）、李（Prunus domestica）（蔷薇科Rosaceae）、油橄榄（Olea europaea）（木犀科Oleaceae）、埃及姜果棕（Hyphaene thebaica）和海枣（Phoenix dactylifera）（棕榈科Arecaceae）种子的甲醇提取物对淡色库蚊三龄幼虫的生物活性。研究人员选取海枣（P. dactylifera）种子提取物进行植物化学筛选和分级萃取。各萃取部位均对淡色库蚊幼虫进行测试；随后，研究人员测定了最有效萃取部位对三龄幼虫和雌成虫的半数致死浓度（LC₅₀）。进一步测定了石油醚萃取部位对蚊卵和不同龄期幼虫的LC₅₀值。之后，采用液相色谱-电喷雾电离-串联质谱（LC-ESI-MS/MS）对该萃取部位进行分析。结果表明，海枣种子提取物的致死率最高，其次为杏（P. armeniaca）和埃及姜果棕（H. thebaica）。石油醚萃取部位比其他 tested 萃取部位引起更高的死亡率。其对三龄幼虫和雌成虫的LC₅₀值分别为43.7 mg/L和4381.2 mg/L。低龄幼虫比高龄幼虫更敏感。γ-亚麻酸和扁柏素被鉴定为主要化合物，其次为芹菜素、甘油-2-磷酸和二氢辣椒素。海枣种子提取物展现出有前景的杀幼虫活性，尤其是其石油醚萃取部位，凸显了其作为经济有效且环境友好的蚊虫防控候选物的潜力。然而，其对成蚊的效力相对较低，表明需要进一步研究以优化其应用并评估其在蚊虫综合治理中的实际用途。

论文解读

一、研究背景与目的
蚊虫是重要的医学昆虫媒介，可传播多种致命和致残性病原体。淡色库蚊（Culex pipiens）是埃及最常见的蚊种，是西尼罗病毒、裂谷热病毒和班氏丝虫（Wuchereria bancrofti）的主要传播媒介。长期以来，化学合成杀虫剂被广泛用于蚊虫防治，但有机磷、有机氯、氨基甲酸酯和拟除虫菊酯等杀虫剂的密集和不合理使用，已导致蚊虫种群迅速产生抗药性，进而削弱防治效果。此外，多数化学杀虫剂对人畜具有毒性、不易降解、污染环境并破坏生态平衡。因此，亟需寻找替代防治策略。植物源杀虫剂因其靶标特异性、环境友好、可生物降解等优点受到关注。全球水果生产量巨大，随之产生大量废弃种子，造成环境问题。利用废弃种子开发生物杀虫剂，既能变废为宝，又能为蚊虫防治提供新途径。然而，目前有关水果种子废弃物制备绿色生物杀虫剂的研究仍较少。基于此，本研究旨在评估埃及当地五种水果种子提取物对淡色库蚊的杀虫活性，并深入剖析最有效提取物的活性部位及其化学成分。

二、研究内容与主要结论
研究人员收集了杏（Prunus armeniaca）、李（Prunus domestica）、油橄榄（Olea europaea）、埃及姜果棕（Hyphaene thebaica）和海枣（Phoenix dactylifera）五种水果的成熟种子，制备甲醇提取物，并参照世界卫生组织（WHO）标准方法对淡色库蚊三龄幼虫进行毒力测定。结果显示，海枣种子提取物在50 mg/L浓度下48小时致死率最高，达73.3%；杏和埃及姜果棕提取物致死率极低，分别为6.7%和3.3%；油橄榄和李提取物无致死活性。随后对海枣种子提取物进行植物化学定性筛查，发现其含有碳水化合物、甾醇和/或三萜、儿茶酚鞣质及黄酮类化合物，而未检出强心苷、生物碱和皂苷。进一步采用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇对海枣总甲醇提取物进行分级萃取，并对各萃取部位进行生物测定。结果表明，石油醚萃取部位在100 mg/L浓度下对三龄幼虫的致死率最高（90%），显著高于其他萃取部位，且与参照杀虫剂溴氰菊酯的活性无显著差异。经概率分析，该石油醚萃取部位对三龄幼虫的LC₅₀为43.7 mg/L（置信限41–46.8 mg/L），对雌成虫的LC₅₀为4381.2 mg/L。为明确最敏感发育阶段，研究人员将该LC₅₀浓度分别施用于蚊卵和不同龄期（L1–L4）幼虫。结果显示，该浓度对卵的孵化抑制率较低，处理组和对照组间无显著差异；而在幼虫阶段，48小时后一龄和二龄幼虫的死亡率最高，三龄次之，四龄最低，表明低龄幼虫更为敏感。最后，利用液相色谱-电喷雾电离-串联质谱（LC-ESI-MS/MS）对石油醚萃取部位进行分析，共初步鉴定出16种代谢物，包含3种黄酮、3种黄酮苷、4种酚酸及其衍生物、2种生物碱和4种其他化合物。主要成分依次为γ-亚麻酸（50.78%）、扁柏素（31.57%）、芹菜素（3.89%）、甘油-2-磷酸（1.86%）和二氢辣椒素（1.25%）。这些化合物中，γ-亚麻酸、扁柏素、芹菜素、木犀草素、木犀草素-7-O-葡萄糖苷、咖啡酸和辣椒素等均被报道具有杀虫活性，其协同作用可能解释了该萃取部位对淡色库蚊幼虫和成虫的毒效。

三、主要技术方法
研究人员从埃及西部省El-Mahalla El-Kubra市当地市场购买五种成熟果实，经分类学鉴定后人工分离种子，阴干粉碎。种仁粉末分别用甲醇超声提取，减压浓缩得粗提物。参照WHO标准生物测定法，以淡色库蚊三龄幼虫为靶标筛选五种种子提取物（50 mg/L）及海枣种子提取物的四个溶剂萃取部位（100 mg/L），并设溴氰菊酯为对照。对活性最高的石油醚萃取部位，分别对三龄幼虫和雌成虫测定LC₅₀；将所得LC₅₀浓度用于蚊卵和L1–L4不同龄期幼虫的浓度-反应生物测定。采用LC-ESI-MS/MS（负离子模式）结合MS-DIAL及ReSpect数据库对化学成分进行非靶向鉴定。所有数据用SAS 9.13（GENMOD、ANOVA、Tukey检验）和GraphPad Prism 8.3.0进行统计分析，LC₅₀用LDP line软件进行概率分析。

四、结果分述
（一）五种水果种子提取物对三龄幼虫的杀虫活性筛选
对照组的死亡率在24小时和48小时均为0。48小时后，海枣种子提取物致死率最高（73.3%），显著高于其他提取物和对照组；杏和埃及姜果棕的致死率很低，油橄榄和李的提取物无致死作用。GENMOD分析表明，处理因素及处理与时间的交互作用显著影响死亡率，而时间因素本身无显著效应。

（二）海枣种子提取物的植物化学筛选
定性化学试验显示，海枣种子提取物中含有碳水化合物、甾醇和/或三萜、儿茶酚鞣质和黄酮类化合物，未检出强心苷、生物碱和皂苷。黄酮类化合物可能与其杀虫活性有关。

（三）海枣提取物不同萃取部位对三龄幼虫的活性比较
四种萃取部位中，石油醚部位的死亡率最高（90%），显著高于二氯甲烷（20%）、乙酸乙酯（14%）、正丁醇（32%）及对照组（8%），且与溴氰菊酯的活性无统计学差异。正丁醇部位也显著高于对照，但活性明显弱于石油醚部位。

（四）石油醚萃取部位的LC₅₀测定
对三龄幼虫，五组浓度（20–60 mg/L）处理48小时的概率分析显示，LC₅₀为43.7 mg/L，拟合优度良好。对雌成虫，采用改良的CDC瓶生物测定法，五组浓度（2500–4500 mg/L）处理48小时，LC₅₀为4381.2 mg/L。幼虫的敏感性远高于成虫，可能与幼虫表皮较薄、连续水相暴露有关。

（五）浓度-反应测定（杀卵与不同龄期幼虫的敏感性）
用LC₅₀（43.7 mg/L）处理卵筏，处理组卵死亡率为11%（69/614），对照组为6%（36/574），差异不显著，表明该浓度无明显杀卵作用。对不同龄期幼虫，24小时时二龄和三龄死亡率较高；48小时后一龄和二龄死亡率最高，三龄次之，四龄最低，说明低龄幼虫更敏感。

（六）LC-ESI-MS/MS化学成分分析
负离子模式下共初步鉴定出16种化合物。以峰面积归一化法确定主要成分：γ-亚麻酸占50.78%，扁柏素占31.57%，芹菜素占3.89%，甘油-2-磷酸占1.86%，二氢辣椒素占1.25%。此外还鉴定出木犀草素、橙皮素、山柰酚-3-O-α-L-鼠李糖苷、木犀草素-7-O-葡萄糖苷、芹菜素-7-O-葡萄糖苷、3,4-二羟基扁桃酸、5-甲氧基水杨酸、咖啡酸、水杨酸、辣椒素和甘氨酰-L-脯氨酸等。

五、讨论与结论
讨论部分指出，海枣种子甲醇提取物对淡色库蚊三龄幼虫的高致死率与已有报道一致。石油醚萃取部位的活性最强，可能是因为非极性溶剂萃取了具有杀虫活性的脂溶性成分。其LC₅₀（43.7 mg/L）与多种植物石油醚提取物的活性相当，表明该部位具有潜在应用价值。幼虫与成虫敏感性差异归因于表皮结构、暴露方式及解毒酶活性的阶段依赖性。LC-ESI-MS/MS鉴定出的主要化合物中，多种已被证实具有杀虫活性，其协同作用可能是毒效的来源。同时，作者也指出了本研究的局限性：所有实验均在实验室条件下完成，田间气候、光照等生态因素可能影响实际效果；幼虫食物与萃取物成分之间可能存在的相互作用未被评估；对非靶标生物的影响仍需明确；特定化合物的贡献及制剂化、稳定性和田间施用等问题有待进一步研究。研究结论为：海枣种子提取物对淡色库蚊三龄幼虫具有最高的致死率；石油醚萃取部位是主要活性部位，对三龄幼虫和雌成虫的LC₅₀分别为43.7 mg/L和4381.2 mg/L；低龄幼虫比高龄幼虫对LC₅₀更敏感；该部位在实验室条件下具有作为杀虫活性化合物潜在来源的价值，但仍需进一步评价其最有效化合物及作用机制。