埃及乳制品来源乳酸菌胞外多糖（EPS）的发酵优化及其抗氧化、抗菌、抗肿瘤与抗HAV活性研究

《Scientific Reports》：Bioactive potential of polysaccharides produced by lactic acid bacteria isolated from dairy products in Egypt

　　

乳酸菌（LAB）因其产生具有潜在健康益处的胞外多糖（EPS）而受到相当关注。本研究旨在优化LAB分离株的EPS生产并评价其生物活性。研究人员在不同培养条件下筛选LAB分离株，并选择20株有前景的分离株用于进一步研究。在初始pH 6.8和37 °C的改良De Man-Rogosa-Sharpe（mMRS）培养基上，EPS产量增加。干聚合物重量（DPW）和黏度范围为1500至17500 mg/l，其中K1的DPW最高。CH3、P2和P4表现出显著的抗氧化和抗菌活性。CH3分离株在甜乳清培养基上生产EPS，并表现出对Caco-2细胞的抗癌活性和对甲型肝炎病毒（HAV）的抗病毒活性，其半数最大抑制浓度（IC₅₀）分别为5859.37和417 μg/ml。高效液相色谱（HPLC）显示，CH3分离株在甜乳清培养基上产生的EPS中存在单糖，包括葡萄糖（40%）、甘露糖（29%）、果糖（17.3%）、半乳糖（13%）和阿拉伯糖（0.7%）。CH3分离株被鉴定为Levilactobacillus brevis，登录号为QB001328。这些发现突出表明LAB来源EPS在食品和健康应用中的潜力。

本研究围绕埃及乳制品来源乳酸菌（LAB；发酵糖类主要产乳酸的革兰阳性菌）所产胞外多糖（EPS；微生物分泌到细胞外的多糖）的发酵优化与生物活性评价展开。引言指出，多糖是胞外生物膜基质的重要组成部分，微生物EPS在食品、化妆品和医药领域具有应用价值；LAB EPS的结构与功能受产生菌株、培养条件及单糖组成、分子量、糖苷键等结构特征影响，尽管已有较多研究，但在生产一致性、结构—功能关系、作用机制以及体内和临床验证方面仍存在挑战。基于此，研究人员旨在优化LAB纯培养的细胞增殖和EPS合成参数，并在体外评价EPS的抗氧化、抗菌和抗病毒活性，以探索其在食品和健康领域的应用潜力。研究从埃及当地市场采集30份乳制品样品，经筛选、发酵条件比较、甜乳清培养、HPLC单糖分析、16S rRNA基因鉴定、MTT细胞毒与抗癌试验及HAV抗病毒试验，认为LAB来源EPS具有多重生物活性，CH3分离株被鉴定为Levilactobacillus brevis，登录号QB001328，为天然食品防腐剂和功能配料研究提供了候选材料。

技术方法概括（不超过250字）：样品为埃及当地市场30份乳制品；甜乳清购自Retal Land Dairy Products Factory。方法包括：用含蔗糖、溴甲酚紫和叠氮钠的mMRS琼脂筛选产EPS菌（紫色变黄）；按Bergey手册进行菌落形态、革兰染色、芽孢、动力、触酶、产气和糖发酵鉴定；在mMRS中37 °C、48 h静态或100 rpm摇床发酵，测黏度和DPW；乙醇沉淀提取EPS；DPPH法测抗氧化；纸片扩散法测抗菌；甜乳清发酵评价；HPLC测单糖；16S rRNA基因PCR扩增、测序及系统发育分析；MTT法测Vero和Caco-2细胞毒性/抗癌；CPE和空斑减少试验测HAV抗病毒活性。

研究结果如下。（1）产EPS乳酸菌的分离与筛选：通过mMRS指示平板筛选，EPS产生使培养基由紫色变黄；产EPS菌来自多数样品，奶酪频率最高48.4%，其次牛奶16.1%、泡菜12.9%、酸奶9.7%，奶油和labena各6.5%，部分样品未获得产EPS菌。（2）通过生理生化特征进行培养物鉴定：通过菌落形态、革兰染色、芽孢、动力、触酶、产气和糖发酵试验，按Bergey手册将分离株鉴定为Lactobacillus spp.和Lactococcus spp.；多数为杆状，部分为球状，均革兰阳性、无动力、无芽孢、触酶阴性。（3）产EPS乳酸菌分离株的选择：通过静态和摇床mMRS发酵48 h测黏度和DPW，结果部分从6类来源选择31株，黏度20.25±0.05至29.35±0.05 cp，DPW 1500±1.00至17500±0.50 mg/l；Y5黏度较高，K1在摇床条件下DPW最高17500±0.50 mg/l；摘要称选择20株有前景分离株进一步研究。（4）抗氧化活性：通过DPPH法，EPS清除率随浓度（1.00—5.00 mg/ml）变化为0.00—85.00%，IC₅₀为0.85±0.20—6.90±0.10 mg/ml；P4的IC₅₀最高6.90±0.10 mg/ml，三浓度清除率为4.70%、17.00%和35.00%。（5）抗菌活性：通过纸片扩散法对10种病原（4株革兰阳性、4株革兰阴性、2株真菌）检测，EPS对部分革兰阳性和阴性菌形成抑菌圈，最大为P4对B. subtilis 35.00±1.00 mm，CH3对P. aeruginosa和E. coli均为29.00±1.00 mm；所有测试EPS对A. niger Nrrl324和C. albicans ATCC10231无抗真菌作用；部分具抗氧化活性的EPS无抗菌作用，提示两类活性作用方式不同。（6）选择性乳酸菌分离株在甜乳清培养基上的EPS评价：通过甜乳清发酵CH3、P2和P4，黏度分别为39.80±0.06、37.10±0.10和38.20±0.09 cp，差异不显著；PDW分别为26000±0.50、20000±1.00和20000±0.50 mg/l，CH3最高，故选CH3。（7）使用HPLC分析选择性CH3分离株的EPS：通过HPLC测得EPS单糖为葡萄糖40%、甘露糖29%、果糖17.3%、半乳糖13%和阿拉伯糖0.7%，呈异多糖特征。（8）通过PCR鉴定选择性CH3分离株：16S rRNA基因扩增获得约1.5 kb片段，DNA产量465.6 μg/μl、纯度1.9；16S rRNA基因测序得到约1500 bp序列，BLAST最近参考为L. brevis ATCC14869（100%覆盖，93.12%一致性），序列登录号QB001328；系统发育树中CH3与L. brevis参考序列聚类，Pediococcus argentinicus CRL776为外群；讨论指出种级鉴定应暂定，需额外分类标记或全基因组分析。（9）EPS L. brevis的细胞毒性和抗癌活性评价：通过MTT法，Vero细胞在至976.562 μg/ml处理24 h后存活率为104.14±0.18—90.10±0.13%，IC₅₀为1858.47 μg/ml；Caco-2细胞存活率为101.34±0.12—66.40±0.20%，高浓度7812.5—12500 μg/ml时抗肿瘤活性为8.23±0.10—11.02±0.15%，IC₅₀为5859.37 μg/ml；形态学见Caco-2细胞数减少、皱缩及细胞死亡。（10）抗HAV活性：通过Vero细胞HAV滴定和CPE/空斑减少试验，HAV滴度为6.5±1 log₁₀ PFU/ml，EPS处理后为5.33±1 log₁₀ PFU/ml，降低1.17 log，有效性18%，IC₅₀为417 μg/ml。

讨论部分总结：讨论将本研究的EPS产量、抗氧化、抗菌、甜乳清培养、HPLC单糖组成、16S rRNA鉴定、抗癌和抗病毒结果与既往研究进行比较，指出EPS生物活性受菌株来源、培养条件及分子量、单糖组成和糖苷键等结构特征影响；16S rRNA基因测序在种水平区分力有限，CH3归属L. brevis应视为暂定；EPS可能通过破坏细胞膜、DNA降解、抑制细胞分裂、诱导凋亡及免疫调节等机制发挥作用，但所有活性均为体外评价，尚需体内研究和详细结构分析验证，未来可关注其作为天然食品防腐剂、功能食品配料及食品和药物生物活性剂的应用。

研究结论翻译：当前研究调查了来自不同泡菜和乳制品的LAB分离株在改良MRS培养基上产生EPS的能力。该聚合物对革兰阳性菌和革兰阴性菌表现出一定的抗菌和抗氧化特性，但对真菌无影响。此外，在甜乳清上产生的聚合物具有抗菌和抗真菌活性，并对甲型肝炎具有抗病毒活性。此外，CH3聚合物对Vero细胞系无毒，但对结肠细胞系有毒。最有效分离株CH3基于基因型特征被鉴定为Levilactobacillus brevis，登录号为QB001328。在评估Levilactobacillus brevis抗癌活性期间，揭示了EPS在癌症预防和治疗中的作用。因此，当其作为由天然产物制成的食品防腐剂并与食物或膳食一起食用时，未来将有助于成为一种天然抗癌物质。