黄热病毒基因型早期分离株遗传多样性差异研究

《Emerging Microbes & Infections》：Differences in genetic diversity between early isolates of yellow fever virus genotypes

　　

摘要 黄热病毒（Yellow fever virus，YFV）是黄病毒属（Orthoflavivirus）的原型成员，可引起黄热病。系统发育研究表明，YFV可分为七个基因型（东非[EA]、东中非[ECA]、西非I[WAI]、西非II[WAII]、南美I[SAI]、南美II[SAII]和安哥拉[ANG]）。研究人员采用下一代测序（Next Generation Sequencing，NGS）技术，利用来自不同采集年份、具有明确传代历史的早期分离株，对YFV七个基因型的遗传多样性进行了调查和比较。七个基因型之间的遗传多样性存在差异，其中ECA基因型的多样性高于EA和WAI基因型，但与WAII基因型无显著差异。研究鉴定出基因型特异性氨基酸（genotype-specific amino acids，GSaas），这些氨基酸存在于所有病毒蛋白中，但不同基因型间存在差异，其中大多数位于构成病毒复制复合体的非结构蛋白中。值得注意的是，EA和ECA基因型中发现的GSaas最少，尽管ECA基因型的遗传多样性高于EA或WAI基因型。总体而言，基于对早期毒株的检测，研究人员表明YFV七个基因型之间的遗传多样性和GSaas存在差异，且并非随机分布，而可能是由不同地理区域的不同灵长类宿主和蚊媒等选择压力所致。对近期毒株遗传多样性和GSaas的检测将有助于研究遗传多样性随时间的变化，而对暴发相关毒株的研究可能有助于更好地理解暴发如何发展，并有助于确定控制其传播的干预措施。 关键词： 黄热病毒；基因型；遗传多样性；下一代测序；单核苷酸变异；黄病毒属

黄热病毒基因型早期分离株遗传多样性差异的系统研究：基于下一代测序的全面分析

一、研究背景与科学问题

黄热病毒（Yellow fever virus，YFV）是黄病毒属（Orthoflavivirus）的代表性成员，属于黄病毒科（Flaviviridae），是黄热病的病原体。YFV是一种蚊媒病毒，通过Haemagogus、Sabethes和Aedes属蚊虫在非人灵长类动物（non-human primates，NHPs）和人类之间传播。黄热病的临床表现可从轻度发热性疾病到伴有出血和严重肝损伤的致死性疾病。目前，YFV仍在撒哈拉以南非洲和南美洲的热带地区流行，涉及47个国家。当感染者进入人口密度高、媒介蚊虫密度高且疫苗接种率低的地区时，通常会发生大规模YFV流行。

YFV基因组为约11 kb的单链正义RNA分子，含单一开放阅读框（open reading frame，ORF），翻译为单一多聚蛋白，经共翻译和翻译后加工产生三种结构蛋白（包膜蛋白[E]、膜蛋白[M]和衣壳蛋白[C]）及七种非结构蛋白（NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5），后者构成病毒复制复合体。基于基因组序列，YFV可分为七个基因型：东非（East Africa，EA）、东中非（East and Central Africa，ECA）、西非I（West Africa I，WAI）、西非II（West Africa II，WAII）、南美I（South America I，SAI）、南美II（South America II，SAII）和安哥拉（Angola，ANG）。系统发育研究表明YFV起源于东非，随后传播至整个非洲大陆，并于17世纪通过奴隶贸易进入西半球。

目前控制黄热病的策略是使用减毒活疫苗（live-attenuated vaccine，LAV）17D株，该株由野生型（wild-type，WT）Asibi株经176次小鼠和鸡组织传代获得。17D株已不再使用，但现有三种疫苗亚株：17D-204、17DD和17D-213。Asibi株与三种17D亚株之间仅有20个共同的氨基酸替换，但减毒的确切机制尚未完全阐明。下一代测序（Next Generation Sequencing，NGS）研究表明，17D LAV株的遗传多样性远低于WT Asibi株。类似现象也见于另一对YFV亲本/疫苗组合：WT法国嗜内脏病毒（French Viscerotropic virus，FVV）及其减毒衍生物法国嗜神经疫苗（French Neurotropic vaccine，FNV）。

除WT YFV Asibi和FVV株（均属WAII基因型）外，利用NGS检测YFV毒株群体遗传多样性的研究甚少。已发表的研究通常直接分析血清样本中的病毒RNA，用于诊断和确定共有基因组序列。首个此类研究对乌干达一名16岁男性血清进行了NGS，但平均覆盖度仅为每核苷酸92个读数。近期一项研究分析了从安哥拉返回中国的一名个体中分离的毒株（ANG基因型CNYF01/2016）。唯一一项高深度序列覆盖的NGS研究调查了2016年安哥拉YFV暴发期间感染ANG基因型毒株的个体在感染过程中多个时间点采集样本的遗传变异。然而，据研究人员所知，NGS从未被用于检测YFV全部七个WT基因型的遗传多样性，以更好地理解暴发如何发展。为填补这一知识空白，研究人员检测了代表全部七个基因型的21株已知传代历史、采集年份各异的毒株的遗传多样性，并纳入部分毒株不同传代历史的样本。

二、研究内容与主要结论

研究人员选取了21株WT YFV毒株，代表全部七个基因型，所有毒株的传代历史已知，且为各基因型可获得的最早分离株。此外，纳入8个不同传代历史的病毒制备物以探讨传代历史对同一毒株遗传多样性的影响。所有病毒均经NGS测序，确定共有基因组序列。由于黄病毒属5'非翻译区（untranslated region，UTR）的长度和核苷酸含量高度一致，而3'UTR长度可变，分析聚焦于ORF核苷酸序列并翻译为氨基酸多聚蛋白编码区。21株毒株的共有序列用于构建以WNV为外群（outgroup）的系统发育树，100次bootstrap重复提供统计支持。结果显示WAI/WAII和SAI/SAII基因型亲缘关系较近，但与EA、ECA和ANG基因型存在分化，与既往研究一致，验证了数据集的可靠性和可重复性。研究中还纳入2016年ANG分离株（GenBank KX010994.1）的共有序列，以确保ANG基因型结果不依赖于1971年分离的单株毒株。如既往报道，1971年和2016年ANG分离株在遗传上高度相似。

各基因型ORF区的每座位核苷酸替换数存在差异：ANG基因型最高（0.0875），EA最低（0.0143），其余基因型介于0.0713（SAI）、0.0411（SAII）、0.0165（ECA）、0.0441（WAI）和0.0315（WAII）之间，但七个基因型的每座位替换数差异未达统计学显著水平。

遗传多样性分析中，所有样本均降采样至每核苷酸723个读数，以一致地比较各毒株的香农熵（Shannon entropy，SE）和单核苷酸变异（single-nucleotide variant，SNV）。各基因型的平均SE值相近（ANG为0.0032至ECA为0.0038）。SNV分析按>1.00%、>5.00%、>10.00%及编码SNV等类别进行。总体上，基因型间SE和SNV存在差异，但同一基因型内各毒株的两种特征水平相当。ECA基因型含SNV数量最多，WAII病毒最少。ECA基因型毒株Ethiopia 1961b在所有检测毒株中SNV数量最高，对第二个制备物分析后结果得到确认。方差分析（ANOVA）显示，基因型间SE均值及>5.00%和>10.00%的SNV频率无显著差异，但>1.00%的SNV频率存在显著差异（F=4，df=20，p=0.0099）。事后Tukey HSD检验表明，ECA基因型的>1.00% SNV数量显著多于EA和WAI基因型。

传代历史影响分析中，8个不同传代历史的病毒制备物（即在Vero细胞中传代1至4次）的共有基因组分析显示同一毒株不同传代之间高度同源。SE和SNV分析表明传代历史未显著改变特定毒株的遗传多样性，不同传代历史的同一毒株制备物之间也无显著差异。

基因型特异性氨基酸（GSaas）分析中，利用Geneious软件生成21株毒株代表七个基因型的共有多聚蛋白序列。分析共发现七个基因型间420个氨基酸差异，其中88个为仅存在于单一基因型的GSaas。SAII和ANG基因型所含GSaas最多，分别为26个和23个。SAII基因型在全部10种病毒蛋白中均有GSaas，ANG基因型除E蛋白外在所有蛋白中均有。相比之下，EA和ECA基因型所含GSaas最少，分别为2个和3个。EA基因型的两个GSaas均位于NS5蛋白，ECA基因型分别在NS4A、NS4B和NS5中各有一个。WAI、WAII和SAI基因型分别有7个、13个和13个GSaas。虽然GSaas存在于YFV编码的所有蛋白中，但仅NS3、NS5和E蛋白含超过7个GSaas。NS3中有11个GSaas，分布于三个基因型（ANG[n=3]、SAII[n=4]和WAII[n=4]）。NS5中有20个，七个基因型均至少有一个。E蛋白中有14个GSaas，其中12个位于两个南美基因型（各6个），五个非洲基因型中仅有2个，提示YFV从非洲传入南美时E蛋白存在强烈的选择压力。E蛋白GSaas主要位于茎/锚定区而非表面暴露区。

三、主要关键技术方法

本研究采用的关键技术方法包括：下一代测序（NGS）技术，利用Illumina NextSeq550平台对病毒RNA进行全基因组测序，使用随机六聚体引物通过NEBNext Ultra II RNA试剂盒经RT-PCR构建NGS文库；生物信息学分析流程，包括使用Abyss 2.3.7以多种kmer大小和读长深度组装完整基因组，使用Bowtie 2重新比对FASTQ序列，SAMtools排序，Picard-tools去除重复读数；遗传多样性量化方法，包括将数据集降采样至每核苷酸723个读数以统一比较，使用RStudio计算单核苷酸变异（SNV）频率，在Microsoft Excel中手动计算香农熵（SE）值；共有序列和系统发育分析，使用Geneious软件（版本2025 1.2）按基因型比对和生成共有序列，使用Clustal以WNV NY99株（GenBank HQ59519.1）为外群构建系统发育树；统计分析采用RStudio和Microsoft Excel进行ANOVA检验（阈值p<0.05）。样本队列来源为21株WT YFV毒株，代表全部七个基因型，采集自不同地理区域和年份，均为各基因型可获得的最早分离株，传代历史已知，另含8个不同传代历史的病毒制备物。

四、研究结果

病毒株纳入与共有序列比较： 选取21株代表七个YFV基因型的WT毒株，均来自不同地理区域和年份，为各基因型可获得的最早分离株，传代历史已知。所有病毒经NGS测序确定共有基因组序列，5'UTR长度和核苷酸含量一致（117个核苷酸），3'UTR因重复序列长度可变，多聚蛋白编码区均为10236个核苷酸。系统发育树显示WAI/WAII和SAI/SAII基因型亲缘关系较近，与EA、ECA和ANG基因型存在分化。各基因型ORF区每座位核苷酸替换数存在差异，ANG最高（0.0875），EA最低（0.0143），但差异未达统计学显著。

WT YFV基因型间遗传多样性差异显著： 所有样本降采样至每核苷酸723个读数后比较SE和SNV。各基因型平均SE值相近（0.0032至0.0038），但SNV数量存在差异，ECA基因型含SNV最多，WAII最少。ECA基因型毒株Ethiopia 1961b在所有毒株中SNV数量最高，经第二制备物分析确认。ANOVA显示>1.00%的SNV频率在基因型间存在显著差异（F=4，df=20，p=0.0099），事后Tukey HSD检验表明ECA基因型显著多于EA和WAI基因型。

特定病毒的传代历史不影响遗传多样性： 8个不同传代历史的病毒制备物（即在Vero细胞中传代1至4次）的共有基因组分析显示同一毒株不同传代之间高度同源。SE和SNV分析表明传代历史未显著改变特定毒株的遗传多样性，不同传代历史的同一毒株制备物之间也无显著差异。

YFV基因型含有基因型特异性氨基酸（GSaas）： 共有多聚蛋白序列分析发现420个氨基酸差异，其中88个为GSaas。SAII和ANG基因型所含GSaas最多（26个和23个），EA和ECA最少（2个和3个）。GSaas存在于所有病毒蛋白中，但NS3、NS5和E蛋白含超过7个。E蛋白14个GSaas中12个位于两个南美基因型，五个非洲基因型中仅2个，提示南美YFV的E蛋白存在强烈选择压力。

五、讨论与结论

研究讨论了遗传多样性水平与GSaas数量之间的不相关性。ECA基因型遗传多样性最高但GSaas数量第二少，EA基因型遗传多样性低且GSaas最少。研究人员认为GSaas并非随机分布，而是由不同地理区域的不同灵长类宿主和蚊媒等选择压力所致。非洲大陆的五个基因型（ANG、ECA、EA、WAI、WAII）利用Aedes属蚊虫传播，而南美YFV主要由Haemagogus和Sabethes蚊虫传播。研究还讨论了SAII与SAI基因型GSaas数量的差异（26个对13个），认为与SAII倾向于在地理灶点发生、特定毒株停留在特定地理区域，而SAI以波浪形式跨大陆传播的生态学差异有关。ANG基因型含23个GSaas，研究人员推断可能与安哥拉YFV的出现模式及缺乏病毒进化有关，因1971年和2016年仅有的两个安哥拉分离株尽管相隔45年，序列同源性极高。EA基因型唯一可能改变蛋白结构功能的GSaas为NS5 N-710-S，该残基位于α31螺旋E基序，该基序构成NS5活性位点的一部分，并参与次级锌结合指的稳定化，该替换将功能基团从酰胺变为亲核体，可能影响RNA依赖性RNA聚合酶（RdRp）的功能。

研究结论：研究提供了关于WT YFV七个基因型遗传多样性变异的重要新信息，并鉴定了区分各基因型的GSaas。遗传多样性与GSaas的出现不相关，ECA基因型遗传多样性最高但GSaas数量第二少。研究通过纳入完整ORF扩展了关于YFV传播的既往知识。数据揭示南美YFV病毒中E蛋白存在选择压力，提示E蛋白在南美YFV适应中发挥更重要的作用。结合既往文献，研究人员认为这至少部分归因于不同地理区域的不同非人灵长类宿主和蚊媒。该研究提供了迄今对YFV遗传多样性最全面的分析，为理解YFV在非洲大陆传播并进入南美的进化过程提供了关键见解。核苷酸序列可在GenBank获取（登录号PX246671至PX246691），NGS数据可在BioProject ID：PRJNA1312863获取。