金黄色葡萄球菌与大肠埃希菌菌血症中循环非经典单核细胞及caspase-1激活的病原特异性差异

《Virulence》：Differences in circulating levels of non-classical monocytes and associated caspase 1 activation during Staphylococcus aureus and Escherichia coli bacteremia

　　

由Escherichia coli和Staphylococcus aureus引起的血流感染（bloodstream infections, BSI）较为常见，并与较高的死亡率相关。宿主免疫应答是BSI临床结局的主要决定因素。在此，研究人员通过表征E. coli或S. aureus菌血症患者外周血髓系细胞亚群以及作为炎症小体（inflammasome）活化替代标志物的caspase-1激活，探讨了天然免疫应答。研究人员前瞻性纳入单微生物菌血症（monomicrobial bacteremia）患者，并通过流式细胞术（flow cytometry）分析外周血样本。研究人员观察到与E. coli菌血症相关的髓系细胞组成和caspase-1激活的显著改变，包括中间型单核细胞（intermediate monocytes）和非经典单核细胞（non-classical monocytes）扩增，以及非经典单核细胞中caspase-1激活增加。相反，在S. aureus菌血症患者中未观察到这些变化。此外，研究人员发现伴脓毒症（sepsis）与不伴脓毒症患者之间髓系细胞亚群频率和caspase-1激活存在差异，揭示了与疾病严重程度相关的不同特征。重要的是，E. coli与S. aureus菌血症之间髓系细胞亚群和caspase-1激活的差异主要归因于感染细菌而非疾病严重程度。此外，研究人员的发现提示，嗜酸性粒细胞计数（eosinophil counts）和caspase-1激活可能作为区分细菌性BSI与病毒感染的潜在标志物。总体而言，该研究强调在研究菌血症期间宿主免疫应答时需同时考虑感染病原体和疾病严重程度，并提示潜在的天然免疫生物标志物可能改善BSI的诊断和临床管理。

研究背景方面，血流感染（bloodstream infections, BSI）是病原体经血流播散所致的感染，Escherichia coli与Staphylococcus aureus是最常见的病原体之一，并与较高死亡率及显著临床异质性相关。宿主免疫应答是BSI临床结局的重要决定因素。天然免疫识别依赖模式识别受体（pattern recognition receptors, PRRs）识别病原相关分子模式（pathogen-associated molecular patterns, PAMPs）；核苷酸结合寡聚化结构域样受体（nucleotide-binding domain leucine-rich repeat containing proteins, NLRs）可促进炎症小体（inflammasome）组装，导致caspase-1激活及IL-1β、IL-18成熟。髓系细胞包括经典单核细胞（classical monocytes, CM）、中间型单核细胞（intermediate monocytes, ITM）和非经典单核细胞（non-classical monocytes, NCM）。既往脓毒症单核细胞亚群研究常受微生物学数据报告不一致限制，按病原体分层研究天然免疫应答的证据较少。因此，研究人员比较E. coli与S. aureus菌血症患者循环髓系细胞亚群及caspase-1激活，并评估病原体与疾病严重程度的相对贡献。研究纳入35例单微生物菌血症患者（E. coli 22例，S. aureus 13例）及23例健康对照，发现E. coli菌血症存在ITM和NCM扩增及NCM中caspase-1激活增加，而S. aureus菌血症无此表现；ITM与病原体和脓毒症严重程度相关，NCM频率及caspase-1激活主要呈病原驱动，嗜酸性粒细胞减少主要与疾病严重程度相关。该研究提示研究菌血症宿主免疫应答需同时考虑感染病原体和疾病严重程度，并提示天然免疫标志物在诊断和临床管理中的潜在价值。

关键技术方法方面，该研究为前瞻性研究，样本队列来源包括法国Nice大学医院感染科和重症监护病房（intensive care unit, ICU），以及法国Cannes和Antibes的ICU，纳入时间为2019年6月至2022年3月；纳入成人单微生物E. coli或S. aureus菌血症患者，要求纳入前72小时内至少1次血培养阳性且SARS-CoV-2鼻咽PCR阴性；健康对照来自法国血液机构（établissement Fran?ais du Sang, EFS）的志愿献血者（n=23）。研究人员采集外周血并以全血流式细胞术检测CD45⁺、CD14、CD16、CD66b、CD15、CD10、Siglec-8及FAM-FLICA探针标记的活性caspase-1，分析单核细胞和粒细胞亚群频率及其中位荧光强度（median fluorescence intensity, MFI）；按Sepsis-3定义，以脓毒症相关器官衰竭评估（sepsis-related organ failure assessment, SOFA）评分≥2判定脓毒症。

研究结果如下。第一，在“NCM count and associated caspase-1 activation are increased during E. coli bacteremia but not S. aureus bacteremia”中，研究人员通过全血流式细胞术比较健康对照、E. coli菌血症和S. aureus菌血症患者，发现E. coli菌血症患者ITM和NCM频率升高、CM比例相应降低，且NCM中caspase-1的MFI升高；S. aureus菌血症患者未见上述变化。两组菌血症患者未成熟中性粒细胞频率均升高；S. aureus组未成熟中性粒细胞caspase-1的MFI较E. coli组略低。E. coli菌血症患者嗜酸性粒细胞计数降低并伴嗜酸性粒细胞caspase-1激活增加。年龄及症状出现至采样时间未能解释上述髓系细胞变化。第二，在“Disease severity influences frequency of circulating myeloid cells and associated caspase-1 activation during bacteremia”中，研究人员按是否伴脓毒症分层，发现ITM频率仅在脓毒症患者中升高；NCM频率在脓毒症与非脓毒症间无差异；NCM中caspase-1的MFI在脓毒症和非脓毒症患者中均较健康对照升高且幅度相近；脓毒症患者嗜酸性粒细胞显著降低，非脓毒症患者未降低，且脓毒症患者嗜酸性粒细胞caspase-1激活增加；未成熟中性粒细胞频率在脓毒症患者中呈非显著升高（1.31% vs 1.12%，p=0.11），其caspase-1激活在脓毒症与非脓毒症间无差异。第三，在“NCM?associated caspase 1 modifications during E. coli bacteremia are driven by the involved bacteria not disease severity”中，研究人员按病原体和疾病严重程度联合分层，发现E. coli脓毒症患者ITM频率高于S. aureus脓毒症患者（p=0.011），非脓毒症患者间无差异；E. coli组内脓毒症患者ITM频率高于非脓毒症患者（11.4% vs 5.4%，p=0.038）。NCM频率在E. coli菌血症中高于S. aureus菌血症，脓毒症亚组差异显著（9.5% vs 4.9%，p=0.041），非脓毒症亚组呈趋势（13.4% vs 5.8%，p=0.094）；E. coli组内非脓毒症与脓毒症间NCM频率无差异（p=0.87）。NCM中caspase-1激活升高在E. coli菌血症中不由疾病严重程度驱动。S. aureus脓毒症患者CM比例高于E. coli脓毒症患者，CM中caspase-1激活无显著差异。未成熟中性粒细胞频率及caspase-1激活无法区分病原体与疾病严重程度的相对贡献；嗜酸性粒细胞减少主要由疾病严重程度驱动，其caspase-1激活差异无法区分病原体与严重程度贡献。与重症或危重症SARS-CoV-2感染比较时，NCM频率在COVID-19中显著低于S. aureus和E. coli菌血症；caspase-1激活在细菌与病毒感染间无显著差异。摘要同时提出嗜酸性粒细胞计数和caspase-1激活可能作为区分细菌性BSI与病毒感染的潜在标志物。

讨论部分总结指出，该研究提供了关于E. coli与S. aureus菌血症患者循环髓系细胞组成及caspase-1激活的病原特异性改变的新见解。ITM增加与细菌属及疾病严重程度均相关；NCM频率增加及caspase-1激活增加主要呈病原特异；嗜酸性粒细胞减少与疾病严重程度相关；E. coli与S. aureus在NCM caspase-1激活上的差异主要在非脓毒症患者中识别。讨论将结果与Thaler et al.的实验性内毒素血症研究、既往BSI及革兰阴性脓毒症单核细胞亚群研究相比较，并提及采样时间、SOFA评分及方法学差异。讨论提出TNFa（tumor necrosis factor a）可在体外促进单核细胞向NCM表型分化，且革兰阴性菌血症中TNFa水平通常较高。关于炎症小体，讨论比较了ASC-speck阳性单核细胞相关研究，指出采样时间及全血与PBMC方法差异需谨慎解释；本研究以FAM-FLICA检测到NCM中caspase-1激活，且较高激活与非脓毒症状态相关。讨论亦指出嗜酸性粒细胞减少已在菌血症中描述，内毒素血症模型可见循环成熟嗜酸性粒细胞快速下降，而本研究中剩余嗜酸性粒细胞caspase-1升高，提示其发生炎症小体激活，但功能意义尚需研究。局限性包括：以FAM-FLICA检测细胞内酶活性caspase-1，虽广泛用于单细胞水平评估，仍需免疫印迹检测caspase-1加工或gasdermin D裂解等生化分析验证；病原分类依赖常规血培养，培养确认的单微生物感染不一定代表真正的单微生物感染；未来需纳入更广临床结局及相同原发感染部位患者进行比较。全血分析可避免Ficoll纯化对CM和NCM频率的人工影响；该队列以非ICU管理为主、死亡率较低，有利于识别病原特异性免疫签名。研究结论部分翻译如下：在此，研究人员为改进患者炎症小体活化评估提供了关于前提条件的新见解：均一的细菌病因、单核细胞亚型的深入分析以及不同疾病严重程度亚组。研究人员表明，将免疫表型分析与天然免疫激活生物标志物结合，可利用患者外周血样本区分E. coli与S. aureus。这些发现为未来研究病原特异性免疫应答提供了框架，并可能最终促进免疫调节治疗时代更精准的免疫监测策略的发展。