《Virulence》：ISKpn28 transposition and genomic alterations in λ-Red recombinants of hypervirulent Klebsiella pneumoniae: Whole-genome sequencing and phenotypic analysis
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摘要：λ-Red重组系统（λ-Red recombination system）常用于研究肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）的基因功能；然而，重组菌株中非预期的继发性基因组改变可能无法通过位点特异性验证方法（如聚合酶链反应（PCR）和S
摘要：λ-Red重组系统（λ-Red recombination system）常用于研究肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）的基因功能；然而，重组菌株中非预期的继发性基因组改变可能无法通过位点特异性验证方法（如聚合酶链反应（PCR）和Sanger测序（Sanger sequencing））检出。在临床高毒力肺炎克雷伯菌（hypervirulent Klebsiella pneumoniae，hvKp）菌株K255中进行rmpA突变体构建后，两个重组衍生株在位点特异性验证中显示相同结果，证实了预期的rmpA替换。然而，这些菌株在糖醛酸（uronic acid）含量和与小鼠巨噬细胞的相互作用方面存在差异。研究人员因此采用整合短读长和长读长数据的全基因组测序（whole-genome sequencing，WGS）来探究潜在的继发性基因组改变。两个重组衍生株均在nlpD基因内携带一个额外的染色体ISKpn28拷贝。K255ΔrmpA-1菌株还表现出55,652碱基对的染色体缺失，而K255ΔrmpA-2菌株携带与ISKpn74相关的质粒倒位（plasmid inversion）。这些发现为临床hvKp菌株K255重组衍生株中的ISKpn28转座提供了基因组学证据，并强调整合长读长测序的WGS在评估携带ISKpn28的λ-Red衍生重组hvKp菌株全基因组完整性方面的潜在价值。关键词：高毒力肺炎克雷伯菌；λ-Red重组；表型变异；全基因组测序；ISKpn28；继发性基因组改变
研究背景与目的：高毒力肺炎克雷伯菌（hypervirulent Klebsiella pneumoniae，hvKp）最初主要在东亚报道，现已在北美、欧洲和非洲等洲被识别，具有全球临床相关性。与经典肺炎克雷伯菌不同，hvKp可在健康个体中引起侵袭性感染，包括肝脓肿、脑膜炎、肺炎、眼内炎和脓毒症，并常伴转移性感染；高黏液性是其标志，rmpA为黏液黏度关键调节基因，与黏液样表型和毒力增强相关。λ-Red重组系统（λ-Red recombination system）常用于肺炎克雷伯菌基因功能研究，但重组菌株中非预期继发性基因组改变可能无法通过聚合酶链反应（PCR）和Sanger测序（Sanger sequencing）等位点特异性验证方法检出。临床hvKp菌株K255中构建rmpA突变体后，两个重组衍生株在位点特异性验证中结果相同，确认预期rmpA替换，但二者糖醛酸含量和与小鼠巨噬细胞相互作用不同。研究人员因此采用整合短读长和长读长数据的全基因组测序（WGS）及表型分析，比较K255ΔrmpA-1与K255ΔrmpA-2，并表征非预期基因组改变。研究结论为：两株均在nlpD内携带额外染色体插入序列（insertion sequence，IS）ISKpn28拷贝，K255ΔrmpA-1还有55,652 bp染色体缺失，K255ΔrmpA-2有ISKpn74相关质粒倒位；这为临床hvKp菌株K255重组衍生株中ISKpn28转座提供了基因组证据，并强调长读长WGS评估全基因组完整性的潜在价值。
主要关键技术方法（不超过250字）：K255为韩国大邱Keimyung University Dongsan Hospital一例化脓性肝脓肿患者临床血流分离株，Kleborate鉴定为KL2/ST65。研究人员用λ-Red系统将质粒携带rmpA替换为四环素抗性盒；表型检测包括string test、沉降抗性黏液黏度试验、糖醛酸比色法、RAW264.7小鼠巨噬细胞吞噬与黏附试验及生长曲线。基因组分析采用Illumina NovaSeq X短读长和PacBio Revio长读长，Unicycler混合组装，NCBI原核基因组注释流程（PGAP）注释，BLAST/ISfinder分析ISKpn28位点，PCR和Sanger测序验证接合区，minimap2、Integrative Genomics Viewer（IGV）及补充比对标签（SA:Z tag）计数分析质粒倒位。
研究结果：
**Validation of rmpA replacement in recombinant strains**：研究人员通过大小诊断PCR、接合区特异性PCR及Sanger测序，K255ΔrmpA-1和K255ΔrmpA-2均得到预期2,575 bp扩增子和上下游接合序列，确认rmpA替换；同时观察到两种表型不同菌落。
**Distinct phenotypic characteristics of recombinant strains**：通过沉降抗性黏液黏度、string test及糖醛酸比色，无四环素时两株黏液黏度无显著差异；有四环素时K255ΔrmpA-2黏液黏度高于K255ΔrmpA-1，string test拉丝更长；K255ΔrmpA-2糖醛酸含量在两种条件下均较高。
**Differences in phagocytosis and adhesion between recombinant strains**：用RAW264.7细胞在四环素条件下检测，K255ΔrmpA-2吞噬后菌落形成单位（CFU）显著低于K255ΔrmpA-1；K255ΔrmpA-1黏附显著高于K255ΔrmpA-2，示巨噬细胞相互作用不同。
**Growth comparison of recombinant strains**：四环素条件下生长曲线及曲线下面积（AUC）分析显示，K255ΔrmpA-1的AUC高于K255ΔrmpA-2。
**WGS and structural analysis of recombinant strains**：短长读长WGS组装注释显示两重组体均有额外染色体ISKpn28拷贝，位于nlpD同一位置，且保留亲本ISKpn28位点；K255ΔrmpA-1有WT坐标1,066,885–1,122,537的55,652 bp染色体缺失，完全丢失50个注释基因、5个基因成为假基因，并出现GNAT家族N-乙酰转移酶（GNAT family N-acetyltransferase）与tRNA(Met) cytidine acetyltransferase TmcA注释差异；K255ΔrmpA-2的ISKpn28侧翼5-bp直接重复（direct repeat，DR）为“GGTGG”，插入片段仅含ISKpn28，nlpD破坏产生两个假基因；K255ΔrmpA-2还有ISKpn74侧翼质粒倒位，不改变基因内容；PCR/Sanger及10个菌落验证克隆固定，长读长映射显示倒位边界比对不连续和SA标签增加。
**Genomic contexts of ISKpn28 loci**：对K255ΔrmpA-2的11个ISKpn28位点分析显示，3个位于注释编码区，7个位于基因间区，1个位于clpA-clpS缺失接合处；该接合处无侧翼DR，左翼为clpA下游，右翼为clpS上游，对应区域比参考菌株ARLG-10778短2,162 bp；K255ΔrmpA-1中左翼和DR来自nlpD，右翼和DR位于hypD，无完整DR对。
讨论部分总结：本研究意外发现λ-Red衍生重组体中ISKpn28转座和继发基因组改变；两株尽管PCR/Sanger确认rmpA替换相同，表型和体外毒力相关性状不同。四环素条件下黏液黏度差异仅出现于含四环素条件，而K255ΔrmpA-2糖醛酸较高在两种条件均存在，但因二者均保留四环素抗性盒，不能排除其极性或转录效应。两株有多个继发基因组改变，表型差异不能具体归因于rmpA替换、nlpD内额外ISKpn28拷贝或任何单一改变；需干净同源突变体和回补菌株进一步确定各改变贡献及ISKpn28转座的潜在表型和致病后果。ISKpn28属IS481家族，既往与mgrB破坏和黏菌素耐药及前噬菌体多样性相关，但未专门讨论其转座；本研究基于亲子代比较提供转座基因组证据：K255ΔrmpA-2额外拷贝仅含ISKpn28、侧翼5-bp DR，并与亲本ISKpn28位点共存，符合IS481家族拷贝-粘贴转座模型。优势是短长读长WGS直接比较亲本和重组衍生株，实现全基因组评估；局限为仅两个重组株、单一亲本和一次突变构建实验，不能确定复发、频率、时间顺序、插入位点偏好、分子机制和广泛生物学意义，也不清楚染色体缺失和质粒倒位是自发还是与λ-Red突变构建相关；表型试验为体外毒力相关表型，不确立毒力或致病潜力差异。
研究结论翻译：尽管如此，这些发现表明，常规基于PCR和Sanger测序对预期λ-Red重组的确认可能不足以排除基因组其他部位的非预期基因组改变。因此，在将表型差异归因于目标遗传修饰之前，对于携带ISKpn28的hvKp菌株来源的λ-Red重组体，可考虑采用整合长读长数据的WGS进行验证。
