《Expert Review of Vaccines》：Progress toward HIV-1 subtype C vaccines: understanding antiviral immune mechanisms and viral adaptation
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HIV-1 C亚型（HIV-1C）占全球感染的大多数，撒哈拉以南非洲承受着不成比例的疾病负担。尽管经过数十年研究和多项临床试验，针对该亚型或任何其他HIV亚型的有效预防性疫苗仍不存在——且与在发达国家最常流行的亚型相比，针对C亚型的候选疫苗研究较少。预计美国从
HIV-1 C亚型（HIV-1C）占全球感染的大多数，撒哈拉以南非洲承受着不成比例的疾病负担。尽管经过数十年研究和多项临床试验，针对该亚型或任何其他HIV亚型的有效预防性疫苗仍不存在——且与在发达国家最常流行的亚型相比，针对C亚型的候选疫苗研究较少。预计美国从2026年起削减对C亚型流行地区的HIV治疗和预防项目的资助，使得开发有效疫苗的紧迫性比以往更加严峻。本综述探讨了专门针对HIV-1 C亚型病毒的实验性疫苗研究和临床试验，包括临床前和临床试验中所用载体和蛋白质抗原的覆盖情况、在动物和人体中测试的疫苗方案，以及为提高抗原稳定性和免疫原性而进行的修饰，并结合其他亚型的研究发现进行讨论。研究者讨论了各种疫苗策略的适宜性和可行性，并就高C亚型流行率的发展中国家预防HIV感染的策略提出了建议。
1. HIV-1 C亚型疫苗需求的介绍
HIV-1在全球许多地区仍是重大公共卫生问题，撒哈拉以南非洲负担最为严重。全球超过4000万人感染HIV-1，2025年预计新增感染143万例。美国从2026年起削减治疗和预防资助可能导致非洲新增感染和死亡率上升，并将影响UNAIDS 2030年目标的实现（95%诊断、95%治疗、95%病毒抑制）。尽管HIV治疗和暴露前预防取得巨大进展，若其他干预措施减少，仍需要有效的HIV疫苗。HIV-1分为M、O、N和P四个组，M组导致当前大流行，包含A、B、C、D、F、G、H、I、J、K十个亚型及循环重组型（CRFs）。HIV-1C是全球最流行的亚型，占感染50%以上，是撒哈拉以南非洲大多数感染的病因，但仍无有效预防性疫苗。这一差距在数十年研究和众多临床试验后依然存在，且C亚型候选疫苗的研究关注度低于发达国家常见亚型。
2. 早期HIV感染事件是疫苗的靶标
HIV的传播途径影响疫苗设计和递送方式，包括性传播、针具传播、母婴传播以及通过精液、血液、阴道分泌物和母乳等体液或细胞传播。每种情景可能需要不同的疫苗接种策略，因为接种物中的病毒载量和感染部位不同。HIV-1通过CD4和辅助受体CCR5或CXCR4靶向CD4+ T细胞。理想的HIV疫苗应答应在病毒进入细胞前中和病毒。一旦病毒进入细胞，逆转录为DNA并通过病毒整合酶插入宿主基因组，前病毒可在记忆CD4+ T细胞中长期潜伏，这是HIV控制的主要挑战之一。早期HIV感染的关键事件之一是肠道CD4+ T细胞耗竭，这早于血液或淋巴结中的损失。因此，疫苗不仅需在这些部位诱导强劲的T细胞应答，还需在其他 mainly 黏膜部位诱导。另一个挑战是HIV在免疫系统无法检测的细胞内形成储存库并潜伏的能力，这发生在感染早期，疫苗需诱导能在其发生前清除感染或清除潜伏病毒的免疫应答。
3. HIV精英控制者及其对疫苗设计的启示
少数HIV感染者不进展为AIDS，能在无药物情况下持久控制HIV-1感染，被称为“精英控制者”（EC）或长期不进展者。HIV控制是多因素的，包括免疫应答和遗传背景。潜伏HIV整合在EC染色体上的独特位置，这些位点可能对应不允许活跃病毒转录的基因组区域。然而这些似乎是感染早期事件，因为基因组变异低，推测活跃复制的HIV被免疫系统清除。有限数量的EC感染毒力较低的HIV-1或具有限制HIV-1感染的遗传背景（如CCR5缺失）。某些人类白细胞I类抗原等位基因（HLA-1s）在EC中过表达，被视为保护性。这些HIV肽被细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）识别并抑制病毒血症。EC的先天免疫应答扩大了自然杀伤（NK）细胞群体，可通过抗体依赖性细胞毒性识别和杀死HIV感染细胞。NK细胞和记忆NK细胞在EC中比进展者显示更大的细胞毒性活性。NK细胞受体杀伤免疫球蛋白样受体（KIR）2DL2/3与保护性HLA-1等位基因之间的关联支持某些EC具有HIV控制的遗传易感性。研究EC的免疫应答为HIV疫苗设计提供了感染后病毒抑制的启示。CTL应答与HIV控制相关，仅少数EC具有广谱中和抗体（bnAbs）。CTL应答针对病毒功能受限部位，更多靶向保守Gag表位而非其他HIV蛋白。保守Gag表位是不能耐受突变的，因为它们是蛋白质功能和组装所必需的。这一观察导致了包含马赛克表位或保守区域疫苗的设计。并非所有T细胞应答都等同，HIV疫苗研究未显示与EC相同水平的T细胞应答，这可能解释T细胞靶向HIV疫苗缺乏疗效。一个重要发现是疫苗诱导的HIV特异性CD8+ T细胞毒性能力在进展者中显著低于EC。对HIV感染靶标的低效杀伤是由于低T细胞受体抗原敏感性。EC具有强劲的CTL应答，产生多种细胞因子并具有细胞毒性。其应答包括效应记忆T细胞，相对快速，不仅系统性而且存在于黏膜隔室，包括肠道相关淋巴组织和生殖道黏膜。
4. HIV疫苗需要诱导的免疫应答
4.1 T细胞应答与HIV-1疫苗
CD8+细胞毒性淋巴细胞和CD4+辅助T细胞对限制HIV复制均至关重要，尽管CD4+细胞是病毒感染的主要靶标。CD4+ T细胞通过协调应答编排免疫控制；在未经治疗的慢性HIV-1C感染者中，分泌IFN-γ的Gag特异性CD4+ T细胞应答呈免疫优势。重要的是，病毒控制与应答广度而非强度相关，反映跨多位点的多表位靶向。CD8+ T细胞通过T细胞受体识别MHC I类分子呈递的HIV衍生肽，触发穿孔素和颗粒酶介导的细胞溶解，直接消除感染细胞。Gag特异性CD8+ T细胞应答与未经治疗的慢性HIV-1C感染者较低病毒载量显著相关。然而，HIV易错复制产生逃逸变异体逃避CD8+识别，这些变异体通过HLA驱动的免疫压力被选择，其积累在急性感染期间尤为明显。相反，获得适应度成本的逃逸突变体——尤其是功能受限Gag区域的——可能处于劣势，代表病毒适应的潜在约束。当CD8+逃逸通过病毒突变或T细胞耗竭发生时，结果是进行性免疫失调和不受控的病毒复制。HIV在人群中的进化轨迹受HLA遗传学的深刻塑造。特定HLA等位基因在个体间一致选择相同的HIV突变，强调宿主遗传背景如何决定对病毒的免疫压力。某些HLA等位基因赋予保护——例如HLA-B57和HLA-B58与延迟疾病进展和有效控制相关。相反，其他等位基因与快速进展相关。有证据表明感染后保护的HLA等位基因对HIV疫苗接种具有更有效的细胞应答。这种HLA驱动的选择具有可测量的群体后果。在博茨瓦纳，HLA-B57和HLA-B58高度流行，CTL逃逸突变的流行率在10年间相对稳定，表明与不同HLA背景的群体相比病毒对CTL压力的适应较慢。重要的是，传播后HIV-1 CTL逃逸突变若受体携带不同HLA等位基因，可回复为共识序列，重置病毒基因型以匹配新免疫压力。因此，预防性疫苗要成功，靶表位必须具有有限逃逸途径或携带高适应度成本使逃逸变异体功能受损。纳入受病毒适应度或HLA驱动选择模式约束的表位可能防止逃逸并建立持久的疫苗诱导免疫。EC和HIV候选疫苗接种者中观察到的T细胞应答存在关键差异。多项疗效试验基于设计诱导T细胞应答的疫苗。当它们未成功时，结论是T细胞应答不足以控制HIV。然而最近一项比较复制缺陷型三价腺病毒（Ad）血清型5 gag/pol/nef B亚型疫苗与EC的T细胞应答质量的研究显示实质性差异。由于HIV感染靶标上抗原水平低导致脱颗粒受损，细胞毒性能力显著低于EC。这提示了解释这些疫苗抗病毒活性差从而导致临床试验缺乏疗效的机制。需要进一步研究选择能引发保护性T细胞应答的疫苗平台和免疫方案。高度暴露持续血清阴性（HESN）女性性工作者中自然HIV抵抗的机制可为疫苗策略提供信息。在内罗毕HESN性工作者的大多数生殖道和血浆中发现低水平HIV特异性IgA，能够中和B、A和D亚型病毒分离株。这些抗体还能抑制HIV黏膜跨细胞转运。在超过50%的HESN性工作者血液和生殖道中发现针对HIV-1 CTL表位的CD8+淋巴细胞应答。有证据表明女性可多年保持未感染，但在某些情况下停止性工作导致感染，性工作中断对系统性T细胞记忆表型有微妙影响。这意味着暴露于HIV抗原是维持阴性状态的重要方面，暗示疫苗可能需要加强或持续暴露于抗原的策略。
4.2 广谱中和抗体作为HIV-1疫苗设计靶标
在某些HIV感染者中发现广谱中和抗体（bnAbs）引发了关于如何诱导这些抗体以及疫苗若能诱导此应答将有多有效的研究。HIV Env结合CD4受体和辅助受体CCR5或CXCR4感染T细胞。由于Env被聚糖重度屏蔽，仅某些区域可供抗体结合，包括CD4结合位点、V1/V2顶端、V3环、gp41 MPER和gp120/gp41界面。一些中和抗体引起Env蛋白构象变化，从而消除与受体的结合。bnAbs的诱导始于Env靶向稀有前体B细胞，产生非中和抗体。通过漫长的迭代过程，随着Env在感染过程中突变，B细胞亲和成熟可导致bnAbs产生。确定疫苗如何诱导bnAbs的挑战很大。迄今表征的抗体不寻常之处在于具有长重链互补决定区3并与多种抗原多反应性，包括一些宿主抗原。这导致产生bnAb的前体B细胞因自身反应性和耐受机制在骨髓中被删除。HIV Env上的靶中和表位也高度糖基化，因此常对免疫系统不可见。非中和表位占优势，在B细胞和滤泡辅助T细胞生发中心与亚优势表位竞争。bnAbs可预防感染的概念验证在非人灵长类中显示，被动给予mAb（PGT 126）保护免受阴道和直肠SHIV暴露。随后进行了2b期试验给予bnAb VRC01，称为抗体介导预防（AMP）试验，预防了对VRC01敏感的HIV-1的获得。为在南非进行该试验做准备，研究人员从感染后100天内分离的毒株构建了200个HIV-1 C亚型包膜假病毒面板。感染早期获得的病毒比后期分离的病毒更耐受中和。在南非，随着病毒随时间进化，它们对VRC01等单克隆抗体的中和更加耐受。然而在2016年之前，VRC01在治疗水平中和了面板中80%的病毒。随着C亚型疫情持续监测，观察到循环病毒间更大的分化。AMP试验在南非进行（HIV-1 C亚型占主导），证明VRC01预防了对抗体敏感的HIV-1的获得。然而VRC01并未比安慰剂更有效地预防HIV-1获得，表明大多数传播病毒在给定滴度下对该抗体不敏感。发现安慰剂组参与者分离的HIV中仅30%对VRC01抗体敏感。未来试验将研究抗体组合以提高疗效。这些结果表明制造中和HIV预防感染的疫苗非常具有挑战性。bnAb诱导的最新方法是靶向多样化bnAbs的种系前体。因此，设计免疫原靶向 na?ve B细胞前体是靶向可成熟为产生bnAb细胞的种系的方法之一。需要诱导多个抗体谱系以应对传播HIV的多样性。在一项1期临床试验中，包膜糖蛋白（Env）三聚体BG505 SOSIP.v4.1-GT1.1的种系靶向（GT）在大多数疫苗接受者中诱导了VRC01类bnAb前体。该研究提供了GT方法激活bnAb前体并驱动亲和成熟向成熟bnAbs发展的概念验证，研究人员现在将确定需要哪些加强免疫原以改善bnAb谱系。最近一项非人灵长类研究证明了种系靶向疫苗设计的原则：BG-18种系靶向初免后异源加强（包括HIV-1C衍生Env蛋白）在>50%动物中诱导了广谱中和抗体（bnAbs），加强系列中可见渐进性亲和成熟。这是种系靶向方法的重大里程碑。然而该方案存在显著实际限制。初免阶段包括每隔一天给予七次递增剂量免疫，随后数月内七次异源加强免疫，共14次免疫。这种密集给药方案依赖于机制发现，即长初免产生具有更高体细胞超突变率和改善非优势表位识别的B细胞，从而抑制脱靶免疫优势B细胞应答并富集生发中心靶向bnAb前体。然而虽然这种机制理解解释了方法的成功，该方案仍与标准HIV临床试验设计不相容（通常6-12个月内3-4次访视），尤其与现实世界疫苗接种规划不相容。此外，适应HIV-1亚型间广泛遗传变异将需要每个亚型不同的抗原组合，这将极大复杂化制造和递送。在种系靶向疫苗进入人体疗效试验之前，必须解决两个关键证据缺口。第一，>50% bnAb诱导对于概念验证可接受，但对于多样化远交群体中的实用疫苗不够，前体B细胞频率的异质性可能进一步降低应答率。第二，尚未证明疫苗诱导的bnAbs是否提供灭菌性或感染后控制，保护是否与bnAb广度和效力相关，以及bnAbs单独赋予保护还是需要互补的CD8+和CD4+ T细胞应答。一项人体试验中，mRNA疫苗体内产生膜锚定HIV-1 Env三聚体，三剂后在108名无HIV成人中80%诱导中和抗体（nAbs），而仅4%接受可溶性三聚体mRNA疫苗者产生。自体和同源2级nAbs在第二剂后首次出现，第三剂后滴度增加。血清抗体持续长达六个月。这一结果可能例证了在体内制造Env疫苗抗原的优势，而非在表达系统中生产后纯化时严格选择正确构象。然而令人关注的是，7名（6.5%）参与者观察到疫苗相关荨麻疹，5名经历慢性荨麻疹，其中4人在12个月时仍有症状。
4.3 非中和抗体在HIV疫苗中的作用
唯一显示 modest 保护（31%）的HIV预防性疫苗试验在泰国进行，称为RV144试验。它测试了三种免疫原——重组金丝雀痘病毒ALVAC（vCP1521携带env gp120，AE亚型，株92TH023）和AIDSVAX（由B亚型株MN和循环重组型CRF01_AE株A244的gp120蛋白组成），以铝佐剂为辅。gp120蛋白具有N端11氨基酸缺失和单纯疱疹病毒gD蛋白衍生标签。与许多其他预防性HIV疫苗试验不同，RV144试验诱导了介导一系列抗病毒活性的抗体。RV144试验中降低风险的主要相关因素是V2特异性抗体，与多个HIV-1亚群交叉反应并识别构象和线性表位。尚不清楚抗V2抗体应答是否直接导致感染率降低。观察到针对V2和V3线性表位的结合，提示这些表位也有助于保护。通过高功能免疫球蛋白G3（IgG3）的Fc介导效应应答作为非中和抗体应答的一部分被观察到。IgG3是IgG的次要部分，具有效应功能包括补体激活、抗体介导的吞噬和抗体介导的细胞毒性（ADCC）应答。高水平Env特异性IgA抗体与感染增加相关，推测这可能减轻了保护性抗体的效果。值得注意的是，虽然试验两年后保护效力为31%，但一年后约为60%，提示定期加强可能维持了可提供更高保护的免疫水平。在HVTN 505测试中，DNA初免后重组腺病毒血清型5（rAd5）和IgG3 V1V2抗体广度与较低的HIV获得可能性相关。虽然试验未达到效力，这一结果与其他HIV疫苗效力试验中抗V1V2抗体为免疫相关因素的趋势一致。
4.4 黏膜免疫：HIV疫苗开发的空白之一
由于HIV-1C感染的主要途径之一是通过黏膜表面，了解保护这些表面所需的条件很重要。虽然黏膜病原体可通过外周疫苗接种诱导的抗体控制，但对如何在这些表面诱导T细胞了解甚少。黏膜相关淋巴组织（MALTs）具有组织驻留记忆细胞（TRMs），需要抗原递送到靶黏膜，特定效应细胞被招募并保留为TRMs。值得注意的是，了解HIV感染者中的TRMs是“HIV治愈”研究的焦点。在非人灵长类模型中，用DNA疫苗（SIVmac251-env和gag）初免并通过鼻内扁桃体注射加强的动物免受高致病性SIVmac251重复低剂量直肠内攻击。一项临床试验评估了HIV阴性女性志愿者肌内（IM）、鼻内（IN）和阴道内（IVAG）给予候选HIV-1 C CN54gp140包膜糖蛋白疫苗的系统和黏膜免疫应答。IM组中检测到针对1级C亚型病毒的低中和应答，仅略超过三分之一参与者可检测到阴道IgG，检测到低CD4应答。尽管IN组无可检测抗体应答，80%参与者有可检测的循环CD4 T细胞应答。IVAG给药即使IM初免后对系统或黏膜应答无可检测影响。该研究清楚说明了诱导和评估HIV疫苗黏膜免疫应答的困难。
5. 临床试验中HIV-1C候选疫苗的抗原选择
表1总结了HIV-1C疫苗的关键临床试验及其结果。首个HIV-1 C亚型候选疫苗基于委内瑞拉脑炎病毒（VEEV）复制子表达南非C亚型分离株Du422的Gag蛋白，选择因其接近南非C亚型共识序列（HVTN 036）。在HVTN 073和HVTN 086试验中，南非艾滋病疫苗倡议（SAAVI）候选DNA疫苗（SAAVI DNA-C）含有两个质粒pTHr.grttnC和pTHr.gp150CT的等摩尔混合物，表达源自Gag、逆转录酶（RT）、Tat和Nef的多蛋白以及截短的Env。基因基于与来自分离株Du151和Du422的南非C亚型共识序列的接近性。所有基因经密码子优化以提高人体表达，并修饰以提高安全性、稳定性和免疫原性。Tat通过重排基因片段灭活同时保留所有潜在T细胞表位；RT活性位点突变；从gp160胞质尾去除124个氨基酸；Nef和Gag肉豆蔻酰化位点灭活。该疫苗作为SAAVI-MVA C2（具有匹配蛋白）加强的初免。SAAVI DNA和SAAVI MVAC-2疫苗与源自南非HIV-1C原代分离株TV1的HIV-1 C亚型V2缺失gp140联合测试。V2缺失TV1显示比天然序列更具免疫原性。基于TV1的疫苗也用于HVTN 088。一种基于重组腺相关病毒血清型2（rAAV2）的疫苗（tgAAC09）编码HIV-1 C亚型Gag、蛋白酶和部分逆转录酶（Gag-PR-DRT），基于南非分离株DU422序列（NCT00482027）。编码序列经密码子优化并从CMV IE启动子表达。在HVTN 100中，ALVAC-HIV（vCP2438）表达C亚型分离株的Env、Gag和Pro序列以及HIV-1 env gp120（HIV-1C ZM96，基于HIV-1 96ZM651，赞比亚原代分离株）、env gp41跨膜区、gag和蛋白酶（均为B亚型HIV-1 LAI）编码序列。二价C亚型gp120包含两个HIV-1C重组单体env蛋白TV1.C和1086.C。1086.C是来自赞比亚的C亚型HIV-1包膜，为奠基者/传播HIV-1C，与TV-1一起提供南部非洲C亚型多样性的互补覆盖。HVTN 503（Phambili）试验测试了基于腺病毒的MRKAd5 HIV-1 gag/pol/nef B亚型疫苗，旨在引发T细胞介导免疫应答以确定是否能提供针对HIV-1感染的保护或降低获得后病毒载量。虽然未测试HIV-1C抗原，但旨在确定基于B亚型的疫苗是否能提供针对HIV-1C的保护。HVTN 705/HPX2008（Imbokodo）试验测试了Ad26.Mos4.HIV四价疫苗（由Ad26.Mos1.Gag-Pol、Ad26.Mos2.Gag-Pol、Ad26.Mos1.Env和Ad26.Mos2S.Env组成，C亚型）和来自株97ZA012（1997年南非C亚型分离株）的重组三聚gp140蛋白，以磷酸铝佐剂。Ad26.Mos4.HIV加C亚型gp140未提供针对HIV-1获得的保护。
6. 临床前HIV-1C疫苗开发
在临床前研究中，出现了几种改进的HIV-1C候选疫苗。大多数免疫方案是结合多种疫苗平台的初免-加强策略。Env抗原的选择已从Env最接近共识或传播/奠基者病毒的分离株转向具有bnAbs个体的Env。研究人员通过各种修饰进一步改进Env设计。可溶性Env三聚体（SOSIP gp140）结构模拟天然膜结合Env刺突（gp160），已被广泛研究以确定稳定构象所需的突变。SOSIP方法的潜在缺点是需要弗林蛋白酶共表达，可导致部分Env未切割。另一种方法是在gp120和gp41亚基界面采用柔性富含甘氨酸的连接肽，使重组Env在无蛋白水解切割情况下呈现天然构象。具有柔性连接子的HIV-1C Env已被证明在动物模型中诱导2级HIV-1 nAbs。还有将Env呈递为纳米颗粒以增强nAb诱导的策略。然而尽管B亚型Env有前景，通过将截短Env与甲型流感血凝素茎融合提高C亚型Env在细胞表面表达密度的尝试未增加抗Env抗体。mRNA编码膜结合HIV Env免疫在动物模型中有前景，与相同蛋白的可溶性版本相比引发改善的应答，减少脱靶碱基导向Env应答和更强的nAb应答。这在临床试验中得到确认。虽然对Gag的T细胞应答与EC中HIV控制相关，疫苗中包含的Gag设计各异。早期出芽Gag颗粒被视为安全问题，因此许多疫苗中去除了肉豆蔻酰化信号。然而Gag作为病毒样颗粒生产显示显著改善的免疫原性，并证明当免疫系统用DNA或BCG疫苗初免时是良好的加强。HIV-1C研究了多种疫苗平台，关键平台在以下章节描述。应注意，虽然未测试HIV-1C疫苗，巨细胞病毒平台被认为是HIV疫苗最有前景的平台之一。
6.1 卡介苗（BCG）作为HIV-1C疫苗载体
源自牛结核的结核疫苗卡介苗（BCG）作为疫苗载体有几个优势，包括低成本、热稳定性、非常成熟的安全记录、证明适用于新生儿以及细胞壁成分和脂蛋白作为内置佐剂。BCG作为HIV疫苗载体的早期研究大部分在HIV-1 C亚型抗原上进行。BCG已显示在小鼠和非人灵长类模型中有效初免HIV免疫应答，这些应答可通过亚单位、痘病毒和腺病毒疫苗加强。用表达南非HIV-1 C亚型分离株gag基因的重组BCG（rBCG）构建体初免并用HIV-1 C亚型Pr55(gag)病毒样颗粒（Gag VLPs）加强的狒狒产生主要CD8+ T细胞介导应答并识别与早期HIV-1 C亚型感染者靶向相似的表位。此外还引发Gag特异性体液应答。因此BCG载体HIV抗原应被视为HIV疫苗方案的高度合适初免。BCG泛酸营养缺陷型（panBCG）在巨噬细胞中生长不良，使其比野生型BCG更安全。C亚型衍生rpanBCG-Gag初免和Pr55Gag VLP加强疫苗方案在狒狒模型中高度免疫原性，诱导广泛多功能中央记忆T细胞应答。该报告进一步表明开发对儿童HIV免疫安全的BCG基HIV疫苗的可行性。另一项研究中，狒狒通过胃管两次panBCG Gag初免并用Pr55gag病毒样颗粒（Gag-VLPs）肌内注射加强。口服panBCG Gag疫苗与Pr55Gag VLPs初免-加强组合在系统和黏膜隔室均诱导疫苗特异性应答。因此BCG表达HIV抗原也应考虑用于初免黏膜HIV免疫应答。猴子用表达HIV抗原的rBCG-rAd5初免-加强疫苗接种后显示良好T细胞应答。rBCG-SIVgag/rDIs-SIVgag初免/加强组合已显示保护猕猴免受SHIV KS661c黏膜攻击。表达SIV Gag的重组BCG（rBCG）后接重组复制缺陷型纽约痘苗病毒（NYVAC）Gag加强在恒河猴中引发强劲Gag特异性初免应答，在致病性SIVmac251重复直肠黏膜攻击后具有保护效果。
6.2 痘病毒作为HIV-1C疫苗载体
不在人体内完成复制周期的宿主限制性痘病毒是受欢迎的疫苗载体候选。证据表明不同痘病毒以不同方式激活免疫系统。痘病毒ALVAC（基于金丝雀痘病毒）、改良安卡拉痘苗（MVA）和NYVAC（均基于痘苗病毒VACV并具有特定缺失）产生不同的先天免疫特征。在BALB/c小鼠脾中比较了静脉感染来自三个属的六种宿主限制性痘病毒物种后24小时的先天应答：块状皮肤病病毒（LSDV）、金丝雀痘病毒（CNPV）、禽痘病毒（FWPV）、MVA和两种新型南非禽痘病毒。LSDV后接MVA诱导最大干扰素（IFN）应答。CNPV和FWPV上调两个免疫球蛋白基因（Ighg和Ighg3（IgG3）），而CNPV还诱导第三个Ighm（IgM）。HIV-1特异性IgG3抗体与RV144试验中HIV-1感染风险降低相关，该试验包括CNPV基载体（ALVAC）。LSDV在兔和非人灵长类中作为HIV疫苗载体测试。LSDV与MVA联合（均表达HIV-1C基因）的免疫原性数据显示该组合方案在恒河猴中免疫原性，诱导高幅度、广泛和平衡的CD4+和CD8+ T细胞应答。这些结果值得进一步研究这些或类似疫苗。痘病毒是良好的疫苗载体，值得注意的是表达埃博拉病毒蛋白的MVA-BN现已作为埃博拉病毒疫苗方案的一部分可用。已有许多临床试验测试痘病毒载体作为疫苗接种方案的一部分；然而仅RV144与ALVAC显示任何效力。此前研究者团队开发了两种候选HIV-1疫苗（SAAVI DNA-C2和SAAVI MVA-C），随后在临床前研究和早期临床试验中测试。虽然这些疫苗诱导gp140 Env结合抗体和1A级病毒中和应答，但未引发2级或广谱中和抗体活性。因此SAAVI MVA-C疫苗设计通过用能形成病毒样颗粒（VLPs）的C亚型马赛克Gag替换Grttn多蛋白来改进，从而增强Gag特异性细胞应答。Env替换为源自产生广谱中和抗体个体的修饰Env。Env截短为gp150；天然前导序列替换为组织型纤溶酶原激活物（TPA）前导肽；弗林蛋白酶切割位点替换为柔性富含Gly的连接序列（GGGGSGGGGSG）；在gp41区域引入稳定化I559P突变。在中国恒河猴（n=5）中，共表达SIVmac239 Gag和与SHIVC109P7攻击病毒匹配的稳定化gp150 Env的DNA和MVA载体，用AlhydroGel中可溶性gp140加强两次，在所有动物中引发IFN-γ ELISpot应答和中等自体和同源2级中和。该方案未预防重复低剂量直肠内SHIVC109P7攻击后的获得，但病毒血症比未接种对照显著更快消退（中位2 vs 8.5周），指向突破后更快的控制而非保护。在恒河猴中，无针递送（Syrijet Mark-II注射器，Keystone Industries）MVA-HIV初免和重组三聚gp120蛋白加强至舌下和颊（SL/B）黏膜增强体液免疫并在直肠、阴道和唾液分泌中诱导强Env特异性IgG和IgA应答。相比之下，局部SL/B施用仅产生最小抗体。它还引发强劲系统体液和细胞应答。在异源SHIV-SF162P3重复低剂量直肠内攻击后，无针——而非局部——SL/B免疫显著延迟感染获得，此延迟与非中和抗体效应功能、Env特异性CD4+ T细胞应答和gp120 V2环特异性抗体相关。另一项研究中，用编码SIVmac251 env和gag的质粒DNA初免并通过直接结内（腭扁桃体）MALT免疫用编码相同基因的MVA加强的恒河猴免受高致病性SIVmac251重复低剂量直肠内攻击。总之这些研究为候选HIV疫苗的黏膜和MALT靶向递送提供了依据。
6.3 mRNA基HIV疫苗
研究人员在各种动物模型中研究了mRNA基HIV-1疫苗，但大多数未超过更传统方法。一个有前景的应答是编码C亚型包膜糖蛋白的自扩增信使RNA（mRNA）在恒河猴中产生强效细胞和nAb免疫应答。这些在幅度上大于病毒复制子颗粒（VRP）包装的mRNA或重组HIV包膜蛋白引发的应答。抗包膜结合（包括抗V1V2）和中和抗体应答大于VRP疫苗诱导的。另一项有前景的研究中，表达全长SIV Gag的mRNA基疫苗在恒河猴中测试治疗活性，最终免疫在治疗中断前立即给予，从而增强SIV特异性CD8+ T细胞。与对照接种RM相比，mRNA/SIVgag接种RM中可测量反弹病毒血症时间显著延迟，确认Gag特异性CD8+ T细胞应答在HIV控制中的重要性。然而反弹未持续。
6.4 纳米颗粒基HIV-1疫苗
免疫学界长期接受颗粒性高度重复抗原引发远更高滴度抗体应答且通常比相同抗原的可溶性亚单位版本持续更久。事实上在HIV和人乳头瘤病毒（HPV）疫苗免疫原性比较中指出主要区别是HPV衣壳构成高度重复抗原的半刚性阵列，而具有Env的HIV病毒体或VLPs的Env分子密度远低，不促进抗体交联。这也已在T细胞应答中证明，Pr55Gag VLPs引发比可溶性Gag抗原（如p24）更好的应答并额外自佐剂。至少自1992年以来已知某些HIV-1截短或全长Gag在真核细胞中表达导致出芽产生类似未成熟HIV病毒体的100-160 nm包膜颗粒，HIV-2也如此。研究者实验室于2004年首次在昆虫细胞中获得HIV-1 C亚型Pr55Gag VLPs表达证据。此前已详细讨论使用Gag基疫苗预防HIV感染的前景以及涉及Gag的临床前试验；因此主要讨论Env基纳米颗粒（NPs）或VLPs。增加HIV-1 Env三聚体在VLPs或NPs表面密度多年来一直是HIV疫苗研究目标，最早报道之一使用B亚型衍生SOS-VLPs（展示二硫键桥接功能三聚Env的Gag VLPs）与未切割Gag+Env VLPs和可溶性gp120比较。另一种在B亚型Gag基VLPs上致密化Env占用的方法是简单修饰gp160的信号肽和胞质尾（CT）及跨膜（TM）区域，包括去除大部分CT：gp150 CT截短版本显著增加Env密度，用蜜蜂蜂毒肽SP替换SP显著改善昆虫细胞表面和VLPs上Env密度。用鼠乳腺肿瘤病毒Env、流感病毒血凝素（HA）或杆状病毒gp64衍生序列替换HIV TM-CT增强修饰Env掺入VLPs 10倍。然而研究者用HEK293T细胞中制造的C亚型Env展示在同源马赛克Gag基VLPs上的经验未重复B亚型结果。简言之，C亚型CAP 256 Env gp160序列在氨基酸残基730处截短产生gp150；天然SP替换为人组织型纤溶酶原激活物前导序列（TPA），弗林蛋白酶切割基序KEKR替换为柔性连接子（FL），引入I559P（I-P）突变。可溶性三聚体版本Gp140-FL-IP在氨基酸653处截短。嵌合Env抗原通过将HIV-1 Env的TM和CT替换为甲型流感H5 HA相应序列（gp140HA2tr）或将Env的gp41区域替换为HA的HA2亚单位（gp120HA2）制造。序列通过重组DNA和表达HIV-1 C亚型马赛克Gag（先前显示有效形成VLPs）和gp150 Env或任一嵌合体的改良安卡拉痘苗（MVA）疫苗表达。HEK293T细胞的免疫荧光显微镜和基于FACS的细胞表面染色显示gp150 Env或任一嵌合体在细胞表面或Gag VLPs上表达水平无显著差异。对天然Env三聚体顶端V1/V2四级表位特异的mAbs结合gp150和gp140HA2tr嵌合体，但不结合gp120HA2嵌合体。用表达gp140HA2tr嵌合体或gp150 Env的DNA和MVA疫苗接种的兔中引发自体和同源2级NAbs，但用gp120HA2 Env免疫者未引发。因此向HIV-1 gp120添加HA2茎未改善VLPs上Env密度或其免疫原性，全长gp150茎是引发针对HIV-1 C亚型nAb应答所必需的。有趣的是，含HA的VLPs在最近原子力显微镜研究中具有更高弹簧常数、弹性模量和断裂力，作者认为嵌合体的结构特性可帮助定制HIV VLPs的力学并可能指导VLPs与宿主细胞间机械相互作用的设计。Env多聚化的其他模式也已探索。较成功之一是使用24聚铁蛋白纳米颗粒或来自嗜热脂肪芽孢杆菌的60聚二氢硫辛酰乙酰转移酶（E2p）展示稳定三聚A亚型BG505 SOSIP.664。两种纳米颗粒均可高产率合成，与一组bNAbs和非NAbs适当反应，并强劲触发表达VRC01受体的B细胞，表明适当表面间距。然而C亚型抗原要么未类似研究，要么与已研究者足够不同不一定表现相同。研究者团队专门针对C亚型疫苗研究的两种技术是将gp140Env（稳定三聚体形成，如上所述）通过gp140-ZeraR融合在哺乳动物细胞中表达形成的蛋白体呈递，以及使用SpyTag/SpyCatcher技术与两种展示载体。ZeraR是源自γ-玉米醇溶蛋白储存蛋白的富含脯氨酸结构域，赋予其N或C端融合伙伴形成大（可达约10 μm）均质蛋白体的能力，在各种表达平台中显著增加产量。gp140-ZeraR融合均未可检测形成蛋白体，但N端融合在兔中引发比ZeraR-gp140更高的针对自体gp140和合成V1V2支架的抗体滴度。抗gp140-ZeraR血清还具有显著更高的1A级假病毒nAb滴度，也优于单独使用的gp140三聚体。SpyTag/SpyCatcher（ST/SC）技术利用源自化脓性链球菌FbaB内含肽蛋白的两个蛋白结构域在生理条件下通过异肽键有效共价连接的能力——以及其高度有用的适配，涉及将肽或蛋白偶联到自组装T=3二十面体纳米颗粒表面，如源自大肠杆菌噬菌体AP205的纳米颗粒。研究者使用AP205呈递，将大肠杆菌中制造的纯化SC-AP205 VLPs与纯化三聚可溶性CAP256 gp150-FL-IP-ST体外偶联产生装饰颗粒，尽管并非所有潜在结合位点被占用。展示在SC-AP205 VLPs上的gp140-ST有效加强用表达Env和马赛克Gag的DNA疫苗初免后用表达相同抗原的MVA加强的兔，如上所述。免疫方案在2/5兔中引发自体和同源2级中和抗体，而单独四次接种gp140-ST未引发这些nAbs。尽管结果有前景，研究者结论gp140 Env三聚体的大尺寸可能不理想用于AP205 VLPs展示，后者由180个紧密堆积单体组成。该研究的后续使用计算设计的i301纳米笼（mi3）展示SC与C亚型CAP255 Env gp140-ST（修饰为CAP256 gp150-FL-IP）。这是首次报道在mi3 NPs十二面体面上形成SpyCatcher五聚体，使得从冷冻电镜图像精确约10 ?三维图像重建成为可能，每个位点被占用。如前，DNA（D）、MVA（M）和蛋白（P）方案以DDMMPP给予引发比其他方案如PPPP、MMPPP或DDMMM更好的nAb应答。兔在第二次NP免疫后产生自体和同源2级NAbs，具有低水平异源CAP256SU nAbs。mi3 NP展示比AP205颗粒更规则和重复，可能导致改善的抗体应答。
6.5 佐剂对CD4滤泡辅助T细胞免疫应答的影响
HIV候选疫苗的一个挑战是Env抗体应答相对短暂并可影响疫苗效力，如RV144试验报道。Env抗体持久性的关键决定因素是生发中心（GC）反应之前的佐剂驱动先天编程。佐剂决定抗原呈递细胞激活强度、迁移至引流淋巴结的效率以及在那里向T细胞传递的信号。它们在初免滤泡辅助T（Tfh）细胞能力上差异显著，因为Tfh帮助对GC持久性有限，这些差异转化为长寿命浆细胞输出的差异，从而转化为Env特异性抗体持久性的差异。在非人灵长类实验中，研究人员研究了不同佐剂。干扰素诱导蛋白10（IP-10）佐剂HIV-1C DNA初免后接单磷酰脂质A和QS-21（MPLA+QS-21）佐剂HIV-1C Env蛋白加强在猕猴中产生更好的抗Env血清IgG滴度，具有更大跨分支反应性、V1V2特异性和效应功能，优于用缺乏IP-10的DNA初免并用MPLA加铝佐剂gp160蛋白加强的猕猴。另一项非人灵长类实验中，研究者比较了编码gp160与Tfh细胞因子干扰素蛋白-10（IP10）和白细胞介素-6的DNA初免后用阳离子脂质体基佐剂（CAF01）gp140蛋白加强，与DNA初免（含IP-10）后用MPLA+QS-21佐剂gp140加强。CAF01诱导GC B细胞具有Tfh1/17偏斜GC Tfh隔室，而MPLA+QS-21偏向GC Tfh1。MPLA+QS-21诱导更好的Env抗体持久性，这对针对HIV的保护性免疫很重要。最大化GC Tfh1诱导对诱导持久Env抗体很重要。上述实验的注意事项是MPLA和CAF01组间初免模式不同，需进一步工作确定这是否导致加强后抗体持久性差异。
7. 结论
诱导针对HIV-1C的灭菌免疫仍是一个异常困难的问题。bnAb前体靶向和颗粒抗原展示的进展有前景。然而可能需要多次疫苗接种，且C亚型特异性跨平台验证仍落后于B亚型。有效疫苗可能需要组合方法，引发持久高滴度bnAbs以及强效黏膜T细胞和Fc效应抗体应答。
8. 专家意见
HIV-1C疫苗开发史是免疫学和分子生物学渐进见解的编年史，间以临床试验失望，但该领域从未如此有能力解决根本问题。HIV-1的遗传多样性证明在不同地区靶向特定亚型合理——在撒哈拉以南非洲，绝大多数主导HIV-1亚型是C亚型。一些临床试验显示疫苗可保护免受与候选疫苗基因密切同源的循环病毒，但不一定针对C亚型病毒，需更多工作。疫苗设计的核心挑战仍是免疫学的：HIV呈现聚糖屏蔽、构象动态的包膜，主动颠覆常规疫苗接种最易诱导的免疫应答。在病毒未进化到完全逃避识别之处，免疫优势诱饵表位分散B细胞应答对bnAbs必须靶向的保守位点的注意。过去十年最重要的概念转变是从经验性抗原选择转向机制指导的免疫原设计。种系靶向策略提供真正概念验证，即bnAb前体B细胞可在人体中接合；然而产生bnAbs所需的漫长亲和成熟——在自然感染中需数年——不太可能被标准初免-加强方案重现，因此该策略不太可能在发展中国家环境中实际应用。同样，将V1V2特异性IgG3应答和Fc介导效应功能鉴定为RV144临床试验中适度保护的相关因素，并在HVTN 100和Imbokodo中将其复制为免疫信号，代表比灭菌性bnAb介导免疫更可及的近期目标。将这些信号转化为效力的持续失败，最近在HVTN 702/Uhambo中，表明抗体应答的幅度和持久性——不仅是功能质量——仍是限制因素。来自广谱中和抗体、精英控制者和HESN队列的教训表明持续抗原暴露对维持功能性B和T细胞免疫至关重要。未来疫苗策略应优先淋巴结和黏膜组织（特别是肠道）免疫，因为这些部位代表病毒遭遇最早点并对产生局部和系统应答至关重要。当前病毒载体平台常未能引发与精英控制者中观察到的相当的T细胞功能。这一差距强调迫切需要改进免疫原递送系统并更清晰机制理解哪些疫苗模式能可靠产生持久保护所需高质量多功能T细胞应答。临床试验应测试不同佐剂以确定亚单位疫苗能否改善HIV抗体应答。mRNA平台在HIV-1C领域值得比已获得更多关注。临床数据显示mRNA疫苗接种体内产生膜锚定Env三聚体在80%接受者中引发2级中和抗体，是该领域历史上最有前景的Env免疫原性信号——尽管一些参与者有显著副作用——值得紧急用C亚型抗原和可能不同制剂跟进。同样，为HIV-1C开发的VLP/纳米颗粒展示策略提供增加Env三聚体密度和B细胞受体交联的合理路径，从而增加免疫原性。其临床前免疫原性特征令人鼓舞，尽管转化为非人灵长类和最终人体研究至关重要。观察到C亚型Env在应用B亚型抗原验证的策略时并不总是可预测表现，是一个反复发现，应作为设计约束认真对待而非次要考虑。C亚型优先免疫原工程应成为默认而非事后考虑——疫苗接种策略应可行，而非复杂的学术练习。
